鵝絨委陵菜根際AM真菌侵染特性及物種多樣性

王玉丹，楊春雪

(東北林業大學 園林學院，哈爾濱 150040)

鹽堿地的土壤中含有大量的可溶性鹽類，其物理化學性質差，會抑制植物生長，甚至導致其死亡，影響農林牧業生產和生態環境的可持續發展。近年來，水、土、生物資源被過度開發利用，日漸干旱的氣候，致使鹽堿化面積不斷增加[1]。作為中國重要的后備土地資源[2]，鹽漬土的恢復、治理與利用刻不容緩。叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)真菌既能和80%的植物構成共生體系，也能作為潛在的接種于鹽漬土的一種真菌[3]。在AM真菌與植物建成共生體系后，植物給其提供光合產物，AM真菌利用其菌絲網絡協助宿主植物汲取水分和養分，兩者互利共生，形成遍布干旱、鹽堿等各種生境的共生體。AM真菌及其龐大的菌絲網絡對于維持鹽土區脆弱的生態平衡具有重要意義[4]。

鵝絨委陵菜(Potentillaanserina)為多年生草本植物，薔薇科委陵菜屬，又稱蕨麻，是一種典型的匍匐莖型蓮座狀植物，有較高觀賞價值，是退化松嫩鹽堿草地恢復初期的主要先鋒物種之一[5]，其耐鹽堿[6-9]且能與AM真菌共生[10]，但對于其根際AM真菌類型及侵染特性卻鮮有報道。在鹽堿土里，AM 真菌種群的結構往往較特別，一些擁有特殊用途比如有強耐鹽堿性的 AM菌種或許就隱藏其中[11-12]，基于此，本研究擬對松嫩鹽堿草地鵝絨委陵菜根際AM真菌的類別進行鑒定，以期開發利用AM真菌資源，獲得更多具有較強耐鹽堿特性的AM真菌菌種，為更好地推廣鵝絨委陵菜-AM真菌共生體在鹽堿地修復中的應用，以及在鹽堿化城市綠化中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究樣地

研究樣地位于松嫩草地西南部黑龍江省肇東市，屬溫帶大陸性半干旱氣候[13]，晝夜溫差較大。該地處于森林草甸和草原區域[14]，降水集中于 7-9月。土壤類型主要有鹽土、堿土和草甸土，鹽土以碳酸鹽為主，堿土主要為碳酸鈉和碳酸氫鈉，堿化草甸土鹽分的含量較少[15]。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣方法 于2018-07-05在肇東市松嫩鹽堿草地上采集鵝絨委陵菜根系土壤及植株。隨機選取鵝絨委陵菜生長茂盛且雜草少的樣地，用“五點取樣法”采集鵝絨委陵菜根際土壤[16]。去除表層石塊及枯枝等雜物，向下挖并收集約10～20 cm深的鵝絨委陵菜根際土壤及根系1.5 kg，最后經“四分法”保留 1 kg，共選取10個采樣地，其位置為125°54′0.72″～125°54′15.85″N，46°2′53.88″～46°2′57.12″E(表1)，將10個樣地的土樣進行編號，記錄其經緯度帶回實驗室，于通風良好的避光處自然風干，用20目篩子篩去雜物，分別裝入密封袋于4 ℃密封儲存。將鵝絨委陵菜的根清洗干凈后剪成1 cm左右根段浸入FAA固定液(福爾馬林 5 mL，冰醋酸5 mL，φ=70%酒精 90 mL)中，標記后放入4 ℃冰箱密封存儲。

1.2.2 AM真菌定殖率的測定 用堿解離-Trypan blue染色法[17]對根進行染色。從固定液中夾出根段，在清水下沖洗至無刺激性氣味后，用φ=10% KOH 90 ℃水浴1 h軟化透明，之后用φ=2%的鹽酸中和30 min，將根段取出，加入曲苯藍試劑(Trypan blue)90 ℃水浴30 min進行染色。將染色后的根段制片，在光學顯微鏡 (OLYMPUS-DSX500)下鏡檢菌絲、叢枝、泡囊等形態結構，統計叢枝豐度(% )、泡囊豐度 (%)、定殖強度 (%)和定殖率(%)[18]，詳細記錄菌絲的形態結構并拍照，之后用 MYCOCALC軟件對數據進行處理。

1.2.3 AM真菌孢子的分離鑒定 將鵝絨委陵菜根際土壤中的 AM 真菌孢子利用濕篩傾析-蔗糖離心法[16]篩取后，將其置于培養皿中，用超聲波清洗儀清洗干凈后在雙管實體解剖鏡下統計孢子個數。體視顯微鏡下初步觀察孢子特征，用移液槍取單個孢子于載玻片上，加乳酸制片，在光學顯微鏡(OLYMPUS-DSX500)下記錄孢子的顏色、紋理，并測量其大小、孢壁厚度等特征。用Melzer’s把孢子染色，記錄其顯色特異性變化并拍照。最后根據《VA 菌根真菌鑒定手冊》[19]及國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM)官網上提供的形態特征描述、圖片，以及近期新發表記錄種的文獻對AM 真菌種類進行鑒定。

1.2.4 土壤pH測定 稱取10 g土樣溶于10 mL去離子水中，震蕩數分鐘，靜止30 min，取上層較清澈溶液用于pH測定。

1.2.5 AM真菌孢子多樣性指標測定 分離頻度(Occurrence frequency,F)：指某種或某屬的真菌在樣本總體中的出現頻率。

F=AMF某種出現的次數/總樣本數×100%

相對多度(Relative abundance,RA)：指某一AM真菌種的個體數在群落總物種數中的比率。

RA=某屬或種的孢子數/該地區AM真菌孢子總數×100%

重要值(Importance value,IV)：IV=(F+RA)/2×100%

1.3 數據分析

用SPSS 17.0軟件對AM真菌多樣性指標進行分析，測定數值用“平均值±標準誤”表示；采用Word 2019繪制表格。

2 結果與分析

2.1 鵝絨委陵菜根際菌根共生的結構特征

樣地中的鵝絨委陵菜根系均被AM真菌侵染，經觀察，其形成疆南星型(Arum-type，A-型)叢枝結構(圖1)。侵染菌絲由根外侵入鵝絨委陵菜根系內(圖1-1)，形成胞間菌絲(圖1-2、1-3)和胞內菌絲(圖1-4)。根內菌絲一部分二分叉式生長形成花椰菜狀的叢枝結構(圖1-5)，一部分頂端膨大形成泡囊(圖1-6)。鵝絨委陵菜根系內泡囊較多，其形狀大多為圓形(圖1-6)，也有部分為橢圓形或不規則形(圖1-7、1-8)。

2.2 鵝絨委陵菜根際AM真菌定殖狀況

試驗結果如表1所示：10個樣地的土壤類型均為堿性鹽漬土，pH為7.60～8.39。各樣地中，鵝絨委陵菜根系均被AM真菌侵染，且侵染率均很高，有70%的樣地達到100%定殖。在不同pH下，根系的定殖狀態不同，當pH為最高(8.39)時，定殖強度和叢枝豐度也為最高，分別為 49.17%和11.41%；而當pH為最低(7.60)，根系定殖率也處于最低值96.30%；在pH為7.70時，泡囊豐度達到最大值21.94%；泡囊豐度和叢枝豐度在pH為8.23時同時達到最低值2.61%和 0.79%，定殖強度在pH為7.72時為最低值20.60%。

2.3 鵝絨委陵菜根際AM真菌的多樣性

試驗結果表明：松嫩平原鹽堿化草地中鵝絨委陵菜根際富含AM真菌資源，共分離出8屬38種AM真菌(圖2)，其簡要描述見表2。其中，球囊霉屬(Glomus)和無梗囊霉屬(Acaulospora)為鵝絨委陵菜根際AM真菌優勢屬，其重要值均大于50%，分別為67.45%和55.98%；原囊霉屬(Archaeospora)的重要值為44.72%，為最常見屬；內養囊霉屬(Entrophospora)和盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)的重要值為27.20%和16.26%，為常見屬；近明囊霉屬(Claroideoglomus)、根生囊霉屬(Rhizophagus)和隔球囊霉屬(Septoglomus)為稀有屬，其重要值均為5.16%。松嫩鹽堿草地鵝絨委陵菜根際優勢AM真菌種類為黑球囊霉(G.melanosporum)，其重要值為60.38%，且在10個樣地中均分離得到；薄壁原囊霉(Ar.leptoticha)的重要值為44.72%，為最常見種；其他常見種和稀有種的類別較多，詳見表3。另外，在所有樣地中，1號和4號的AM真菌種類較多，均為12種，占鑒定出的真菌總種類的30.77%； 7號和9號樣地鑒定出的AM真菌種類較少，為 7種，占總數的17.95%。

1.根外菌絲H(hypha)侵入鵝絨委陵菜根系 Extracellular hyphae；2.根外菌絲侵入根系后形成胞間菌絲H(hypha)及菌絲頂端膨大形成了橢圓形的泡囊V(vesicle) Intercellular hyphae and elliptical vesicles；3.有隔菌絲H(hypha) Septahypha；4.根內菌絲圈HC(hyphal coil) Hyphal coil；5.根內菌絲H(hypha)及菌絲二叉式生長形成的花椰菜狀叢枝A(arbuscule) Hyphae and arbuscular；6.菌絲H(hypha)二叉分支及頂端膨大形成的圓形泡囊V(vesicle) Spherical vesicle；7.有隔菌絲H(hypha)及不規則形的泡囊V(vesicle) Septahypha and irregular vesicle；8.橢圓形及圓形的泡囊V(vesicle) Oval and circular vesicles

圖1 鵝絨委陵菜AM真菌菌根顯微結構
Fig.1 Microstructures of AM fungi ofPotentillaanserina

表1 采樣地位置和AM真菌侵染鵝絨委陵菜根系狀況Table 1 Distribution of sampling sites and colonization of AM fungi in the roots of Potentilla anserina

注：A型菌根即為疆南星型菌根。

Note: AM type A is Arum-type.

表2 松嫩鹽堿草地鵝絨委陵菜根際AM真菌形態描述Table 2 Morphological description of AM fungi in rhizosphere of Potentilla anserine in Songnen saline-alkaline grassland

(續表2 Continued table 2)

屬名Speciesname學名Scientificname顏色Color形狀Shape孢子大小/μmSporesize其他特征Others黑球囊霉G.melanospo-rum黑棕色至黑紅棕色Blackbrowntoblackreddishbrown球形至近球形,卵形或橢圓形Sphericalorclosetospheri-cal,ovateorel-liptical165～250孢子表面常附著不勻的薄壁菌絲,連孢菌絲很難觀察到Thin-walledhyphaeoftenadheredtothesurfaceofthespore,andthehyphaeattachedtothesporeisdifficulttoobserve木薯球囊霉G.manihotis黃色Yellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal162～225(～350)在Melzer,s試劑中呈現淡紫色不均勻大斑塊,連孢菌絲單根,圓筒形或喇叭形,連點開放稍縊縮IntheMelzer,sreagent,therearelargeplaqueswithunevenlavender,andthehyphaeattachedtothesporeissingle,cylindricalortrumpet-shaped,andthepointsisopenorslightlycon-tracted凹坑球囊霉G.multiforum深黃至棕色Darkyellowtobrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal(125～)140(～175)L3孢子壁飾有圓形或卵圓形凹坑ThesporewallofL3decoratedwithroundoro-valpits膨果球囊霉G.pansihalos黃色、黃棕色或黑橘色Yellow,yellowbrownorblackorange球形或近球形,橢球形Sphericalorclosetospheri-cal,elliptical110～190表面有灰白色薄壁菌絲,連孢菌絲單根,直或彎,連點開放或由L3封閉,L1在乳酸中膨脹Thesurfaceofsporeisattachedwithgray-whitehyphae,andthehyphaeattachedtothesporeissingle,straightorcurved,theconnectionpointisopenorclosedbyL3ofsporewall,andL1swellsinlacticacid網狀球囊霉G.reticulatum黑紅棕色Blackredbrown球形、近球形或不規則形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape80～150孢子表面有較規則的網狀紋飾,網紋四邊形或多邊形,連孢菌絲直筒或微漏斗形Thesurfaceofthesporehasaregularquadrilat-eralorpolygonalmeshpattern,andthehyphaeattachedtothesporeisstraightorfunnelshaped彎絲球囊霉G.sinuosum黃色至橙褐色或深棕色Yellow,orangebrownordarkbrown倒卵形、橢圓形,厚垣孢子Obovateorellip-tical,chlamydo-spore44(～80)×82(～150)孢子外層孢壁常密被菌絲,形成孢子果,孢子果球形近球形Theoutersporewallofthesporeisoftendense-lycoveredwithhyphae,formingsporocarp,andthesporocarpissphericalandnearlyspherical地表球囊霉G.versiforme黃至黃棕色Yelloworyellowbrown圓或近圓形Sphericalorclosetospheri-cal90～150L3孢子破裂后可見,呈亮金黃色,連孢菌絲成熟后脫落,連點直或小喇叭狀L3isvisibleafterthesporerupture,anditisbrightgoldenyellow.Thesporehyphaefalloffaftermaturity,andtheconnectionpointisstraightortrumpet-like沃克球囊霉G.walkeri白色至淡黃色Whiteorpaleyellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal(85～)129(～170)在Melzer,s試劑中呈均勻淡紅色或不均勻斑塊狀,連孢菌絲單根,直或彎曲,管狀或擴張SporesarereddishorunevenplaqueinMelzer,sreagent,thehyphaeissingle,straightorcurved,tubularordilated無梗囊霉屬Acaulospora雙網無梗囊霉A.bireticulata淡黃綠色Lilghtyellowgreen球形至橢圓形Sphericaltoel-liptical120～150×140～180孢子表面飾有雙層網紋,網孔呈多角形,孢子中含有透明的小油滴Thesurfaceofthesporeisdecoratedwithdoub-le-layerednetting,themeshispolygonal,andthesporecontainstransparentsmalloildroplets椒紅無梗囊霉A.capsicula橘紅色至辣椒紅Orangeorred球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal170～310發芽壁GW2雙層,GW2-L1表面有珠狀顆粒GerminalwallGW2doublelayer,surfaceofGW2-L1hasbeadparticles空洞無梗囊霉A.cavernata淺黃至黃棕色Lightyelloworyellowbrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal80～150有圓形或卵形凹坑紋飾,坑與坑直接由脊分開,孢子內含物為細小均勻的油滴Thereareroundorovalpitpatterns,thepitsaredirectlyseparatedbytheridges,andthesporecontentsarefineanduniformoildroplets麗孢無梗囊霉A.elegans黃棕色Yellowbrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal90～140L1層狀壁,表面有雙層紋飾,紋飾為密集細刺,刺外附有一層蜂窩狀隆起的透明網ThesurfaceoftheL1hasadouble-layeredpat-tern,decoratedwithdensefinethorns,andatransparentmeshwithahoneycomb-likebulgeattachedtothethorn

(續表2 Continued table 2)

屬名Speciesname學名Scientificname顏色Color形狀Shape孢子大小/μmSporesize其他特征Others凹坑無梗囊霉A.excavata淺黃棕色Lightyellowbrown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal120～165表面有圓至近圓形大凹坑紋飾,有碎屑Thesurfaceofthesporehasaroundtonearlyroundlargedimplepatternwithdebris詹氏無梗囊霉A.gerdeman-nii淺黃色至黃褐色Lightyelloworyellowbrown近球形、卵形或橢圓形Spherical,ovateorelliptical125～200×150～250(～300)孢子外輪廓不整齊,表面不平滑不規則,具有腦紋狀旋繞,易碎,破口邊緣不整齊Theoutercontourofthesporeisnotneat,thesurfaceisnotsmoothandirregular,andithasabrainstriatepattern.Thesporeisfragile,andtheedgeofthecreviceisnotneat光壁無梗囊霉A.laevis淺黃色至棕色Lightyelloworbrown球形Spherical100～250孢壁均為柔性,L1光滑透明;L2層狀淡橙褐色;L3淺黃色Thesporewallisflexible,L1layerissmoothandtransparent;L2layerispaleorangebrown;L3layerislightyellow皺壁無梗囊霉A.rugosa淺黃色Lightyellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal90～120破裂后形成皺折呈波浪狀不脫落Afterrupture,thesporewalliswrinkledandwavywithoutfallingoff細凹無梗囊霉A.scrobiculata淡黃至黃褐色Lightyellowtoyellowishbrown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal110～160表面有凹坑形紋飾,凹坑為圓形、長形、多角形或幾個相連成不規則的彎曲形Thesurfaceofsporehasapit-shapedpattern,andthepitsareround,elongated,polygonalorseveralconnectedinanirregularcurvedshapeAcaulospora.Sporocapia黑紅棕色Blackredbrown球形至橢圓形Sphericaltoel-liptical(160～240)×(125～200)外層壁粗糙內層壁光滑,內層橘粉色或紅紫色Theoutersporewallisrough,theinnerwallissmooth,andtheinnerlayerisorangepinkorreddishpurple刺無梗囊霉A.spinosa淺黃色或深棕黃色Lightyellowordarkbrown球形、近球形或不規則形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape90～300×110～350孢子壁上飾有針狀刺突Aneedle-likeprojectionisattachedtothesporewall疣狀無梗囊霉A.tuberculata紅棕色至深棕色Reddishbrowntodarkbrown球形Spherical150～300L1表面飾有圓形小瘤突,在Melzer,s試劑中呈棕黃色TheL1layerisdecoratedwitharoundedsmallknobandisbrownishyellowintheMelzer,sre-agent原囊霉屬Archaeospora薄壁原囊霉Ar.leptoticha灰白色至淺黃色Graytolightyellow球形、近球形、卵圓形或不規則形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape50～250孢子表面常有一些附著物或呈脫斑狀,有些還具有不明顯的網狀飾物Thesurfaceofsporesoftenhavesomeattach-mentsorarespotted,andsomehaveinconspic-uousmeshornaments內養囊霉屬Entrophospora波羅的海內養囊霉E.baltica淺黃至橘色Lightororange球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal200～270外覆菌絲套,由無色透明至淺黃色、互相纏繞、蜿蜒卷曲的菌絲組成,在Melzer,s試劑中呈胭脂紅色Thesporesarecoveredwithhyphae,whicharecolorless,transparenttopaleyellow,inter-twined,andcurled,andarecarmineredinMelzer,sreagent近明囊霉屬Claroideoglo-mus近明球囊霉Claroideoglo-mus.lamello-sum黃色至暗黃色Yellowtodarkyellow厚垣孢子、球形、近球形Sphericalorclosetospheri-cal,chlamydo-spore95～130連孢菌絲圓柱形,常從孢子上脫落,菌絲壁透明Thehyphaeiscylindrical,oftendetachedfromthespore,andthehyphaewallistransparent根生囊霉屬Rhizophagus根內根生囊霉R.intraradi-ces淡黃色至棕黃色Lightyellowtoyellow-brown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal60～170連孢菌絲一根,孢壁在進入連點時形成火焰狀喇叭形。在Melzer,s試劑中呈深紅色Thehyphaeattachedtothesporeissingle,thesporewallformsaflamingflarewhenenteringthejunction.ThesporeisdarkredinMelzer,sreagent盾巨孢囊霉屬Scutellospora網紋盾巨孢囊霉Scu.reticulata橘紅色至黑紅棕色Orangetoblackreddishbrown圓形至近圓形Sphericalorclosetospheri-cal380～430L1有突起的四至八邊形的網格覆蓋,網格上有鈍圓錐形的刺L1iscoveredbyaraisedquadrilateraltooctag-onalmeshwithabluntconicalthornonthegrid隔球囊霉屬SeptoglomusSeptoglomus.constrictum紅棕色至黑棕色Reddishbrowntodarkbrown球形、近球形Sphericalorclosetospheri-cal125～205連孢菌絲連點縊縮,僅留一狹小孔道,連孢菌絲在連點下方膨大并常向一側彎曲Theconnectionpointissquashed,leavingonlyanarrowchannel,andthehyphaeisswollenbe-lowthejunctionandoftenbendtooneside

(圖續轉下頁 Be continued in next page)

圖2 分離的8屬38種AM真菌Fig.2 38 AM fungi species in eight genus isolated in this study

表3 松嫩鹽堿草地鵝絨委陵菜根際AM真菌多樣性及其分布Table 3 Distribution and diversity of AM fungi around the roots of Potentilla anserina in Songnen salt-alkali grassland

3 討論與結論

本試驗通過對松嫩鹽漬化土地上鵝絨委陵菜根際AM真菌類型及其菌根侵染特性的探究發現，在pH為7.60～8.39的土壤條件下，鵝絨委陵菜根系均有菌根定殖且具有很高的定殖率并形成疆南星型(Arum-type)菌根結構。之前有研究表明，重樓型(Paris-type)菌根結構類型在野生被子植物中占優勢，而本研究結果與此觀點不同，可能的原因是不同植物的根皮層細胞壁結構不同，細胞間隙大小有差異，這些對AM真菌菌根結構的形成有影響[20]。有研究表明，土壤pH越高則會抑制AM真菌孢子的產生和菌根的形成[21]，但本試驗中并未出現這一現象，在不同的土壤pH條件下，鵝絨委陵菜根部都有菌根定殖且具有很高定殖率，而且研究發現pH較高的樣地AM真菌定殖強度高于pH較低的樣地，孢子密度沒有明顯差異。產生這一現象的原因可能是取樣地的pH適合本地AM真菌生存，而且其他土壤因子如土壤肥力、土壤微生物等以及宿主的作用也可能會使AM真菌的定殖率與產孢發生變化[22-23]。

本試驗共分離鑒定出AM真菌8屬38種，包括球囊霉屬20種，占比67.45%，是松嫩鹽堿草地鵝絨委陵菜根圍優勢屬，無梗囊霉屬次之，共12種，占比55.98%，這一結果與前人許多研究結果相似，也驗證了球囊霉屬和無梗囊霉屬為生態適應性較強的兩個屬[24]。球囊霉屬在鵝絨委陵菜根圍占絕對優勢，其種類多分布廣，可能的原因是其產孢率高于其他屬，在屬間競爭中占優勢，并且其本身適應性強，因而成為鵝絨委陵菜以及許多植物的根圍優勢屬，但不同的植物根圍優勢菌種往往不同。摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根內球囊霉(Glomusintraradices)、網狀球囊霉(G.reticulatum)等均為不同地區不同植物中常見的優勢種[25-27]，而在本試驗中，鵝絨委陵菜根圍優勢菌種為黑球囊霉(G.melanosporum)，這可能是因為AM真菌與宿主間的親和性以及兩者彼此間的選擇關系影響優勢菌種種類[28]。眾所周知AM真菌可以增強宿主對礦質養分的選擇性吸收，從而減輕鹽堿脅迫對其生長的危害[29]，但是在鹽漬土的植被修復中，發揮功能的只能是那些對鹽堿脅迫有較強抗性的菌種。本研究鑒定出的AM真菌類別和之前對松嫩平原鹽漬土地上的植物根際AM真菌種類的探究成果[10,27,30]有許多相同菌種，比如根內根生囊霉(R.intraradices)、膨果球囊霉(G.pansihalos)、地表球囊霉(G.versiforme)、薄壁原囊霉(Ar.leptoticha)等，可以考慮這些種類的AM真菌是否具有更強的耐鹽性，為耐鹽菌株的篩選提供思路。

本研究結果表明，松嫩平原鹽漬化草地鵝絨委陵菜根際富含AM真菌資源，今后可加強對其真菌資源的開發并推廣鵝絨委陵菜-AM 真菌共生體在鹽堿地修復中的應用，為AM真菌-植物共生體系在鹽堿化城市綠化中的推廣奠定基礎。