基于mt DNA COI基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定

宋鮮梅，李 敏，何云川，賀海明，王新譜

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021； 2.太原師范學(xué)院 生物系，山西晉中 030619)

近年來，寧夏蔬菜種植面積達(dá)12.7萬hm2，占全區(qū)作物種植面積的10.39%，產(chǎn)值占種植業(yè)總產(chǎn)值的31.48%，蔬菜產(chǎn)業(yè)已成為寧夏的優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)，是區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱[1]。在寧夏蔬菜生產(chǎn)中番茄和黃瓜的種植面積較大，其中番茄栽培以保護(hù)地栽培為主，可周年生產(chǎn)。目前，粉虱危害已成為阻礙番茄可持續(xù)安全生產(chǎn)的重要生物災(zāi)害之一[2]。煙粉虱(Bemisiatabaci)和溫室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)是中國北方地區(qū)最常見的兩種粉虱，均為番茄的重要害蟲，且在寧夏都有發(fā)生報道[3-4]。隨著種植面積的增加，品種的更替，目前寧夏粉虱害蟲的種類及煙粉虱的生物型是否變化，亟需研究確定，進(jìn)而為該類害蟲的綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。

鑒于粉虱類害蟲體型微小，形態(tài)相似，極易隨蔬菜、花卉、水果及其種苗的貿(mào)易活動遠(yuǎn)距離傳播，且難以快速準(zhǔn)確識別，本研究基于線粒體COI基因?qū)幭母鞯販厥覂?nèi)粉虱類害蟲以及煙粉虱生物型進(jìn)行分子鑒定，以期對粉虱類害蟲的快速識別、監(jiān)測、防止入侵等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2018年6-7月在寧夏銀川、永寧、賀蘭山、石嘴山、吳忠、中衛(wèi)、中寧、固原等地種植的番茄、黃瓜和豆角等寄主上采集到19個粉虱種群的77個樣品，采集點分布如圖1所示。將采集的粉虱置于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，備用。粉虱樣品的具體采集信息如表1所示。

1.2 基因組DNA提取

取單頭粉虱成蟲于1.5 mL的離心管中，用適量的1×TE Buffer(solarbio)浸泡2次，每次15 min，用通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀(jì))進(jìn)行總DNA的提取。用SimpliNano 2000分光光度計檢測粉虱基因組DNA質(zhì)量濃度，以 OD260/OD280值確定其是否被污染。提取的DNA -20 ℃保存，備用。

圖1 寧夏粉虱采集地分布圖Fig.1 Distribution of whiteflies-collecting area from Ningxia

1.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

粉虱種類的鑒定：以77個粉虱樣品基因組為模板，利用通用型引物L(fēng)CO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-T-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC- A-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)片段長度約為710 bp。反應(yīng)體系為25 μL，其中EasyTaqMix(全式金)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板300 ng左右，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸 7 min。

煙粉虱生物型的鑒定：以其中的15個煙粉虱基因組為模板，利用通用型引物C1-J-2195 (5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAG-3′)和L2-N- 3014(5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATA TTA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)片段長度約為840 bp[5]。反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存，備用。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，選取與目標(biāo)片段長度一致的單一片段PCR產(chǎn)物送北京華大基因生物技術(shù)有限公司測序。每個種群粉虱檢測3～13頭，共計92條序列。

1.4 序列分析

用Bioedit 7.2.5軟件對公司返回的序列進(jìn)行分析，根據(jù)序列峰圖分別刪除兩端引物序列以及不穩(wěn)定和不準(zhǔn)確序列，以確保序列的高質(zhì)量[6]。登陸NCBI查閱并下載相關(guān)粉虱mt DNACOI基因片段序列，用軟件MEGA 7.0對所測結(jié)果與相關(guān)引用序列進(jìn)行比對分析。

利用軟件中的Kimura 2-parameter 模型計算種內(nèi)與種間遺傳距離。以獲得的寧夏地區(qū)77條COI基因序列和巴西(煙粉虱)、西班牙(煙粉虱)、塞爾維亞(溫室白粉虱)(登錄號分別為MH186144、LN614545和MF688658)3個地區(qū)粉虱COI基因序列為靶標(biāo)，黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)COI基因序列(AB615363)為外群，用軟件MEGA 7.0中鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以獲得的15條Q型煙粉虱COI基因序列和在NCBI下載的相關(guān)序列[序列命名：登錄號+采集地+生物型(有的無)]為靶標(biāo)，同樣以黑刺粉虱COI基因序列為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7-8]。系統(tǒng)發(fā)育樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis，BP)重復(fù)檢測1 000次。用DNASP 5.10軟件分析群體間的核苷酸多樣性(Pi)、核酸平均差異度(K)、單倍型多樣性(Hd)及其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差[9]。在Network 5.0中構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單頭粉虱基因組質(zhì)量濃度

分光光度計檢測結(jié)果顯示，所提取的單頭供試粉虱基因組A260/A280為1.7～1.9，所有基因組質(zhì)量濃度均大于50 ng/μL，滿足試驗需要。

2.2 PCR擴(kuò)增、序列測定以及同源性分析

PCR擴(kuò)增共計獲得92條序列，分別約710 bp和840 bp，電泳檢測結(jié)果見圖2。經(jīng)測序比對并提交到GenBank，獲得基因序列登錄號(表1)。92條COI基因序列與數(shù)據(jù)庫中已知的靶標(biāo)種相對應(yīng)的COI基因片段的同源性均為99.0%～100%，表明所獲得的COI基因序列準(zhǔn)確可靠。所有煙粉虱序列比對，序列MK188909SHC2-1和MK411507MZC1-3與其他序列相比有1個堿基的區(qū)別，分別是第160位的T→C和第333位的G→A；同樣所有溫室白粉虱序列相比，序列MK411530YQC1-2與其他序列相比有1個堿基的區(qū)別是第12位的T→A。結(jié)果顯示：寧夏銀川市西夏區(qū)、中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)和中寧縣的粉虱為Q型煙粉虱；固原市原州區(qū)、吳忠市利通區(qū)、銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱；而石嘴山市大武口區(qū)既有Q型煙粉虱又有溫室白粉虱。

所測Q型煙粉虱與NCBI已知Q型煙粉虱COI基因序列對齊處理，比對長度為639 bp，得知寧夏Q型煙粉虱COI序列完全一致，序列中堿基A、T、C、G的數(shù)量分別為153、282、84和120，A+T的含量為68.08%。Q型煙粉虱以及外群黑刺粉虱mt DNACOI部分序列比對見圖3(列出序列以外的其他序列同MK281483JMC1-4Q)。可以看出寧夏乃至中國與地中海周圍國家意大利、摩洛哥、塞浦路斯等Q型煙粉虱COI序列有0～7個堿基之差，與地中海東部國家伊拉克、伊朗、阿拉伯酋長國等相差31～44個堿基，與美洲一些國家相差大于97個堿基。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DNA marker; A1-12.JMC1-1、YGYR1-1、SJZ1-1、SJZ2-1、SHC1-1、SHC2-1、ZJZ1-1、RYC1-1、MZC1-1、JQC107-5、 JQC114-1、LM94-1; B1-8.LMC141-1、LEC2-1、LEC3-1、YQC1-1、BQC1-1、CYY1-1、XPC1-1、JQC107-1

圖2 引物L(fēng)CO1490/HCO2198對20個粉虱COI基因序列的擴(kuò)增電泳檢測圖
Fig.2 Amplification patterns ofCOIgene in 20 whitefly species using universal

2.3 Q型煙粉虱和溫室白粉虱的種內(nèi)與種間遺傳距離

基于mtDNACOI基因序列，用軟件MEGA 7.0中的Kimura 2-parameter模型計算種內(nèi)與種間遺傳距離。結(jié)果顯示:Q型煙粉虱和溫室白粉虱種內(nèi)遺傳距離均為0～0.001 6，種內(nèi)平均遺傳距離均為0.000 1。種間遺傳距離為 0.360 7，種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的3 607倍。

2.4 Q型煙粉虱和溫室白粉虱的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

用于粉虱種類鑒定的77條COI基因序列和NCBI上已知且具代表性的3條COI基因序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。聚類分析結(jié)果表明，煙粉虱和溫室白粉虱明顯形成獨(dú)立的進(jìn)化分支。由所測15條Q型煙粉虱COI基因序列和在NCBI下載的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)可以看出，煙粉虱COI基因序列首先與黑刺粉虱COI基因序列分開，被測樣本序列與FN557444ItalyQ、KF373113 XinjiangQ、DQ365874 SpainQ等36條已知Q型煙粉虱序列聚為一支，相似度為 99.45%～100%；AM944347 CyprusQ、DQ365878 IsraelQ、HQ198739 USA CaliforniaQ、AF342776 Turkey、AB297895 SyriaQ和KY441512 Costa Rica聚為一支，相似度為 99.74%～100%；KX679574Iraq、AJ510079 Pakistan、DQ133382 United Arab emirates和EU547769Iran聚為一支，相似度為 96.35%～99.61%；AY057129 Guatemala、AF340212 Argentina、DQ133370 Bolivia和KX397318 Mexico聚為一支，相似度為92.09%～98.71%；JQ305088 Bangladesh、EU760742 Cambodia、MF167658 Thailand等聚為一支，相似度為 85.94%～100%。被測樣序列與AM944347 CyprusQ所在這一支序列相似度為98.89%～ 99.17%；與KX679574 Iraq所在這一支序列相似度為94.60%～95.29%；與AY057129 Guatemala所在這一支序列相似度為83.53%～85.32%；與JQ305088 Bangladesh所在這一支序列相似度為84.07%～85.18%。

Identical=. Missing=? Indel=-

圖4 鄰接法構(gòu)建的粉虱基于COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of whitefly species

2.5 遺傳多樣性和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

分析的72條序列共定義22個單倍型(表2)，分別命名為Hap_1～Hap_22。單倍型的多樣性為0.625。單倍型Hap_2共享個體數(shù)最多，占總個體數(shù)的61.11%，被2個及2個以上種群共享的單倍型有Hap_3、Hap_4、Hap_6和Hap_14。總?cè)后w的Pi為0.004 883，K為31.009，Pi和K的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.010 05和0.067。中性檢驗結(jié)果顯示，總種群的Tajima′s D = -1.419 80，F(xiàn)u’s Fs =-2.892，P>0.1，可推斷Q型煙粉虱近段歷史時期發(fā)生過種群擴(kuò)張。用Network 5. 0構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)，在所有樣本中較高頻率單倍型位于圖的左上，其余獨(dú)立的單倍型則通過短支與這幾種高頻率的單倍型相連，從地中海地區(qū)逐漸到地中海東部(圖右上)、亞洲一些國家(圖左下)或美洲國家(圖右下)呈現(xiàn)從高向低頻率擴(kuò)散，出現(xiàn)明顯的進(jìn)化分支，結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合，說明Q型煙粉虱存在種群變異。

圖5 鄰接法構(gòu)建的Q型煙粉虱基于COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining tree based on sequences of COI gene of Q biotype of B.tabaci

圖6 Q型煙粉虱COI基因單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖Fig.6 Median-joining network of haplotypes of Q biotype of B.tabaci based on COI gene

3 討 論

本研究以寧夏19個不同地區(qū)種群的粉虱為試驗材料，采用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198和C1-J-2195/L2-N-3014 擴(kuò)增COI基因序列。分子鑒定結(jié)果表明，在寧夏銀川市西夏區(qū)、中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)、中寧縣、石嘴山市大武口區(qū)均有Q型煙粉虱的分布；在銀川市永寧縣和賀蘭縣、石嘴山市大武口區(qū)、固原市原州區(qū)、吳忠市利通區(qū)、有溫室白粉虱的分布，以上地區(qū)是寧夏蔬菜產(chǎn)業(yè)較發(fā)達(dá)的區(qū)域。除中國北方普遍發(fā)生的溫室白粉虱外，本研究明確了Q型煙粉虱在寧夏的分布情況；而近年來寧夏番茄種植區(qū)不斷加重的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)病也從側(cè)面印證了Q型煙粉虱的存在。寧夏的5個地市中，固原市因海拔較高、氣候冷涼，夏季溫度較低，屬冷涼蔬菜種植區(qū)，該區(qū)域只有溫室白粉虱分布，尚未發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱，究其原因可能與Q型煙粉虱起源于熱帶地區(qū)，冷涼地區(qū)不適宜生存。寧夏的其他4個地市，夏季干燥且溫度較高，蔬菜種植面積大，露地與保護(hù)地栽培方式并存，且大量種植的茄果類和瓜菜類蔬菜為煙粉虱提供了良好的寄主環(huán)境，利于煙粉虱的生存繁殖。

序列比對分析結(jié)果表明，寧夏不同地區(qū)的溫室白粉虱和Q型煙粉虱種內(nèi)遺傳分化現(xiàn)象不明顯，未形成明顯的地理種群。通過系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，寧夏乃至中國與地中海周圍的摩洛哥、突尼斯、埃及、西班牙、希臘、意大利亞等國和非地中海地區(qū)的日本、越南、韓國、加拿大、危地馬拉等國的Q型煙粉虱聚為一支或共享一個單倍型，寧夏Q型煙粉虱所在這一支很有可能是地中海的本土種群，與地中海東部的以色列、塞浦路斯、土耳其、敘利亞共和國等國的Q型煙粉虱相似度高達(dá)98.89%～99.17%，與伊拉克、伊朗、阿拉伯聯(lián)合酋長國、巴基斯坦相似度達(dá)94.60%～95.29%，而與美洲國家的相似度低。本研究結(jié)果與滕希[11]關(guān)于“Q型煙粉虱在中國的發(fā)生現(xiàn)狀及其基于mtCOI序列的系統(tǒng)發(fā)育分析”一文中論述的中國Q型煙粉虱的來源相一致。

馬紹國等[3]報道在寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)發(fā)現(xiàn)B型煙粉虱，而本研究中在相同地區(qū)采集的煙粉虱為Q型煙粉虱，未檢測到B型煙粉虱，且最近研究[12-13]已表明中國農(nóng)區(qū)煙粉虱優(yōu)勢生物型已經(jīng)由B型轉(zhuǎn)為Q型，這可能與兩種不同生物型煙粉虱的競爭替代有關(guān)。很多研究表明，Q型煙粉虱比B型煙粉虱有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢，如Q型煙粉虱發(fā)育歷期比B型煙粉虱短，在低溫和高溫的條件下都表現(xiàn)出更強(qiáng)的生存能力，而且Q型粉虱擁有更強(qiáng)、更廣泛、更穩(wěn)定的抗性[14-16]，二者混合發(fā)生時，經(jīng)過一定的時間，Q型煙粉虱會逐漸成為優(yōu)勢生物型。

4 結(jié) 論

本研究表明，寧夏銀川市西夏區(qū)、中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)和中寧縣的粉虱為Q型煙粉虱；固原市原州區(qū)、吳忠市利通區(qū)、銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱；而石嘴山市大武口區(qū)既有Q型煙粉虱又有溫室白粉虱。同時發(fā)現(xiàn)寧夏Q型煙粉虱應(yīng)源于地中海本土種群。本研究結(jié)果可對不同地區(qū)粉虱的針對性防控提供依據(jù)。