腦心肌炎病毒感染Hela細(xì)胞的內(nèi)吞途徑

劉 楊，許淑娟，李瓊毅，劉翊忠

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030)

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病病原[1]。該病毒于1945年從美國佛羅里達(dá)州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)并分離得到，1985 年確診為豬的致死性病原之一。隨后，多個(gè)國家報(bào)道有該病的爆發(fā)和流行。中國于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV[2]。EMCV感染的臨床癥狀表現(xiàn)為腦炎、心肌炎或心肌周圍炎[3]。豬是EMCV的自然宿主[4-5]，感染后可導(dǎo)致豬突然死亡和實(shí)質(zhì)器官的病理性損傷，母豬感染后還可造成繁殖障礙，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。該病目前尚無有效的治療措施，只能從消滅傳染源和切斷傳播途徑方面著手，如撲殺帶毒老鼠和帶毒豬只等。該病毒可通過多種途徑感染動(dòng)物和人類，但具體的感染機(jī)制目前尚不完全清楚[7]。

內(nèi)吞作用(Endocytosis)是細(xì)胞外物質(zhì)通過質(zhì)膜的變形運(yùn)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過程，也是病毒感染細(xì)胞的常見感染途徑，在病毒感染宿主細(xì)胞的早期發(fā)揮作用。有報(bào)道稱細(xì)胞內(nèi)吞可分為兩種類型，一是經(jīng)典的網(wǎng)格蛋白(Clathrin)參與的內(nèi)吞，二是非網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞，而非網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞主要包括吞噬作用(Phagocytosis)、小窩蛋白(Caveolin)參與的內(nèi)吞途徑和巨胞飲途徑(Macropinocytosis)等[8]。吞噬途徑是指高等動(dòng)物的吞噬細(xì)胞攝取和消滅細(xì)菌、病毒以及損傷細(xì)胞的過程；此途徑中，質(zhì)膜凹陷或形成偽足將入侵物質(zhì)包裹并攝入細(xì)胞，偽足的伸出主要是由肌動(dòng)蛋白(Actin)參與的[9]。有研究表明，肌動(dòng)蛋白參與非吞噬細(xì)胞的內(nèi)吞途徑，主要在病毒感染細(xì)胞的早期發(fā)揮核心作用，抑制肌動(dòng)蛋白可降低多種病毒對(duì)細(xì)胞的感染，如犬冠狀病毒、人冠狀病毒和小反芻獸疫病毒等[10-12]。

為了探究EMCV是否通過內(nèi)吞途徑以及通過哪種內(nèi)吞途徑感染細(xì)胞，本研究先使用內(nèi)吞途徑抑制劑作用于Hela細(xì)胞，然后用EMCV感染處理的細(xì)胞。若病毒感染受到抑制，則使用網(wǎng)格蛋白、巨胞飲途徑、肌動(dòng)蛋白的特異性抑制劑作用于Hela細(xì)胞，然后檢測病毒感染是否受到影響，以此判斷EMCV感染Hela細(xì)胞具體通過哪種內(nèi)吞途徑發(fā)揮作用，以期為臨床上防治EMCV及其他經(jīng)由內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞的病毒提供思路。再者，隨著EMCV感染宿主細(xì)胞機(jī)制的研究不斷深入，有望從抑制內(nèi)吞途徑的主要功能蛋白方面入手，為預(yù)防和治療人與動(dòng)物的腦心肌炎提供更好的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒株

人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、腦心肌炎病毒(EMCV)由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

PCR儀購自Biometra公司；酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher公司；生物熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympns公司；Proliferation細(xì)胞活力檢測試劑盒購自Gromega公司；PVDF膜購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；ECL顯色試劑盒購自PerkinElmer公司；鼠抗VP1 抗體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院白娟副教授惠贈(zèng)，兔抗Actin抗體購自Abcam公司，紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、綠色熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自Jackson Immuno Research公司；DAPI購自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自蘭州民海生物工程有限公司；DMSO、Wortmannin購自北京索萊寶科技有限公司；Bafilomycin A1、Chlorpromazine、Pitstop、1,1′-Dithiobis-2-naphthalenol(IPA-3)、Cytochalasin D、Jasplakinolide購自Abcam公司；NH4Cl購自Sigma公司。

1.3 特異性抑制劑濃度篩選

按照抑制劑說明書，用DMSO或PBS將抑制劑配制成含胎牛血清的不同濃度工作液[12]。試驗(yàn)前24 h將處于對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)分別加入不同濃度的抑制劑工作液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后按照Proliferation細(xì)胞活力檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次，篩選不影響細(xì)胞活力的適合抑制劑濃度。

1.4 EMCV感染Hela細(xì)胞的內(nèi)吞途徑檢測

將對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用適合濃度的內(nèi)吞途徑特異性抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1工作液作用于Hela細(xì)胞1 h，然后用EMCV感染處理的細(xì)胞，接毒時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量之比為0.1∶1(MOI=0.1)，病毒體積=細(xì)胞數(shù)×0.1/0.7×TCID50[13]，接毒1 h后棄去病毒液，換成含NH4Cl和Bafilomycin A1的細(xì)胞維持液，于感染后24 h收集細(xì)胞和上清，檢測病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)[13]。

1.5 網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞途徑檢測

參照“1.4”的方法，使用適合濃度的網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞途徑特異性抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela細(xì)胞后接毒，于感染后 24 h收集上清，檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)。

1.6 巨胞飲途徑檢測

參照“1.4”的方法，使用適合濃度的巨胞飲途徑特異性抑制劑IPA-3和Wortmannin作用于Hela細(xì)胞后接毒，于感染后24 h收集上清，檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)。

1.7 肌動(dòng)蛋白參與的內(nèi)吞途徑檢測

1.7.1 病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)檢測 參照“1.4”的方法，使用適合濃度的肌動(dòng)蛋白特異性抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide作用于Hela細(xì)胞后接毒，于感染后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h時(shí)收集上清，于24 h時(shí)收集細(xì)胞；取 24 h時(shí)收集到的細(xì)胞和上清檢測病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)，并檢測0 h、 6 h、 12 h、18 h、24 h時(shí)上清的病毒滴度，繪制病毒生長曲線。

1.7.2 肌動(dòng)蛋白與EMCV VP1定位檢測 試驗(yàn)前24 h，將處于對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的爬片上，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，接種EMCV，接毒量為0.1 MOI，接毒90 min后棄去病毒液，用1×PBS洗細(xì)胞2次，每次5 min，棄去PBS，向每孔加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，置于4 ℃過夜。第二日取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去乙醇，用1×PBS洗2次，棄去PBS，加入鼠源VP1(1∶200稀釋)一抗，37 ℃孵育1 h后棄去一抗，用PBS洗細(xì)胞4次，每次5 min，棄去PBS；再加入綠色熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，PBS潤洗4次，每次5 min，棄去PBS。然后加入兔源Actin(1∶200稀釋)一抗，37 ℃孵育1 h后棄去一抗，PBS洗細(xì)胞4次，每次5 min，棄去PBS；再加入紅色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，PBS潤洗4次，每次5 min；然后加入細(xì)胞核染料DAPI，孵育10 min，純水洗細(xì)胞10 min；然后取出爬片，倒扣于載玻片上，用熒光封固劑固定，靜置10 min后觀察。

1.8 肌動(dòng)蛋白參與吸附和侵入過程的檢測

試驗(yàn)開始前24 h將Hela細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，使用適合濃度的肌動(dòng)蛋白特異性抑制劑Cytochalasin D工作液作用于Hela細(xì)胞1 h，然后接種EMCV；吸附試驗(yàn)接毒時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量之比為3∶1(MOI=3)，病毒體積=細(xì)胞數(shù)× 3 /0.7 × TCID50[13]，侵入試驗(yàn)接毒時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量之比為2∶1(MOI=2)；然后將吸附試驗(yàn)的接毒細(xì)胞培養(yǎng)板置于4 ℃孵育1 h，侵入試驗(yàn)的接毒細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃孵育1 h；然后取出吸附試驗(yàn)和侵入試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去其中的病毒液，用無血清DMEM洗細(xì)胞 4 次，收集第 4 次洗滌用的無血清DMEM作為背景組病毒；再向其中加入2 mL的無血清DMEM，然后置于-80 ℃超低溫冰箱中反復(fù)凍融3次，收集孔中的病毒液和細(xì)胞碎片，4 ℃、500 r/min離心10 min，吸取上清即為試驗(yàn)組病毒。將收集到的背景組病毒和試驗(yàn)組病毒接種于BHK-21細(xì)胞，并分別測定其滴度和拷貝數(shù)，試驗(yàn)組與背景組的病毒滴度和病毒拷貝數(shù)之差即為最終的病毒滴度和病毒拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性抑制劑濃度篩選

用不同濃度的抑制劑作用于Hela細(xì)胞，24 h后檢測細(xì)胞活力，未加抑制劑的細(xì)胞活力為對(duì)照，篩選不影響細(xì)胞活力的8種抑制劑的適宜工作濃度。結(jié)果如圖1所示：內(nèi)吞途徑抑制劑NH4Cl(20 mmol/L和40 mmol/L)、Bafilomycin A1(10 nmol/L和20 nmol/L)，網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlorpromazine(5 μmol/L和10 μmol/L)、Pitstop(5 μmol/L和10 μmol/L)，巨胞飲途徑抑制劑IPA-3(10 μmol/L和20 μmol/L)、Wortmannin(2.5 μmol/L和5 μmol/L)，肌動(dòng)蛋白抑制劑Cytochalasin D(5 μmol/L和10 μmol/L)、Jasplakinolide(1 μmol/L和2 μmol/L)。

*.差異顯著(P<0.05) Significant diffences(P<0.05); **，*** 差異極顯著(P<0.01，P<0.001) Extremely significant diffences(P<0.01,P<0.001);下同 The same below

圖1 抑制劑濃度篩選
Fig.1 Screening of inhibitor concentration

2.2 EMCV感染Hela細(xì)胞內(nèi)吞途徑檢測

用適宜濃度的內(nèi)吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1分別作用于Hela細(xì)胞后接毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)，收集細(xì)胞檢測VP1含量，以未加抑制劑的細(xì)胞接毒作為對(duì)照組。如圖 2所示，經(jīng)20 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相對(duì)蛋白含量和病毒滴度下降不顯著(P>0.05)，但病毒拷貝數(shù)顯著降低 (P<0.05)；經(jīng)40 mmol/L NH4Cl作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)顯著下降(P<0.01，P<0.001)。經(jīng)10 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)均顯著下降(P<0.05，P<0.01)；經(jīng)20 nmol/L Bafilomycin A1作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)下降更加明顯(P<0.001)。從總體趨勢來看，內(nèi)吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染Hela細(xì)胞。

圖2 內(nèi)吞途徑抑制劑作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.2 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with endocytic pathway inhibitor

2.3 EMCV感染Hela細(xì)胞網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑檢測

使用適合濃度網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用于Hela細(xì)胞后EMCV攻毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)。如圖3所示，經(jīng)過Chlorpromazine和Pitstop作用，病毒滴度和病毒拷貝數(shù)下降不顯著(P>0.05)，提示網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑抑制劑Chlorpromazine和Pitstop不影響EMCV感染Hela細(xì)胞。

2.4 EMCV感染Hela細(xì)胞巨胞飲途徑檢測

使用適合濃度巨胞飲途徑抑制劑IPA-3和Wortmannin作用于Hela細(xì)胞后接種EMCV，收集上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)。如圖4所示，經(jīng)過IPA-3和Wortmannin作用后病毒滴度和病毒拷貝數(shù)下降不顯著(P>0.05)，提示巨胞飲途徑抑制劑IPA-3和Wortmannin不影響EMCV感染Hela細(xì)胞。

圖3 網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑抑制劑作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.3 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Clathrin dependent endocytosis pathway inhibitor

圖4 巨胞飲途徑抑制劑作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.4 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with macropinocytosis inhibitor

2.5 EMCV感染Hela細(xì)胞肌動(dòng)蛋白依賴型內(nèi)吞途徑檢測

2.5.1 肌動(dòng)蛋白抑制劑作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響 用適宜濃度Cytochalasin D和Jasplakinolide分別作用于Hela細(xì)胞后接毒，收集感染后24 h的上清檢測病毒滴度和病毒拷貝數(shù)，收集細(xì)胞檢測VP1相對(duì)蛋白含量，未加抑制劑的細(xì)胞接毒作為對(duì)照組；并檢測經(jīng)10 μmol/L Cytochalasin D作用后0 h、6 h、12 h、 18 h、24 h上清的病毒滴度，繪制病毒增殖曲線。如圖5所示，經(jīng)5 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)下降顯著(P<0.05，P<0.01)；經(jīng)10 μmol/L Cytochalasin D作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)均下降更明顯(P<0.01、P< 0.001)。從病毒增殖曲線也可以看出，在病毒復(fù)制增殖過程中，10 μmol/L Cytochalasin D作用后病毒滴度一直低于對(duì)照組。如圖6所示，經(jīng) 1 μmol/L Jasplakinolide作用后，VP1相對(duì)蛋白含量、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)無顯著下降(P> 0.05)，經(jīng)2 μmol/L Jasplakinolide作用后病毒滴度和病毒拷貝數(shù)下降顯著(P<0.05)。從總體趨勢可以看出，肌動(dòng)蛋白抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide都可以抑制EMCV感染Hela 細(xì)胞。

圖5 Cytochalasin D作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.5 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Cytochalasin D

2.5.2 肌動(dòng)蛋白與EMCV VP1蛋白定位檢測 用EMCV感染生長狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞90 min，再用免疫熒光法對(duì)EMCV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和Actin進(jìn)行染色，然后于鏡下觀察EMCV VP1和Actin的定位。如圖7所示，病毒粒子呈現(xiàn)明顯綠色，Actin呈現(xiàn)明顯紅色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；在Merge圖中可以看出EMCV和Actin在核周圍有明顯的橘黃色共定位區(qū)域。

2.6 肌動(dòng)蛋白參與吸附和侵入過程的檢測

選取對(duì)EMCV復(fù)制增殖影響較大的肌動(dòng)蛋白抑制劑Cytochalasin D，配制成適宜濃度并作用于Hela細(xì)胞，然后接種EMCV，檢測病毒的吸附和侵入。如圖8所示，經(jīng)Cytochalasin D作用后，病毒滴度和病毒拷貝數(shù)無顯著變化(P> 0.05)；如圖9所示，在侵入試驗(yàn)中，經(jīng)5 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度差異不顯著，但病毒拷貝數(shù)差異顯著(P<0.05)，經(jīng)10 μmol/L Cytochalasin D 作用后，病毒滴度和病毒拷貝數(shù)都顯著降低(P<0.05，P<0.01)。提示肌動(dòng)蛋白抑制劑Cytochalasin D對(duì)EMCV的吸附過程無影響，但抑制EMCV的侵入。

圖6 Jasplakinolide作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.6 The impact of EMCV infect Hela cells dealt with Jasplakinolide

圖7 EMCV VP1與Hela細(xì)胞Actin的共定位檢測Fig.7 Co-localization of EMCV VP1 and Actin

3 討 論

EMCV是一種重要的人畜共患病病原，不但可感染多種動(dòng)物和人類，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，而且還威脅人類健康。肌動(dòng)蛋白在多種病毒感染宿主細(xì)胞的內(nèi)吞途徑中發(fā)揮重要作用，如犬冠狀病毒、人冠狀病毒和小反芻獸疫病毒等[10-12]。因此，研究內(nèi)吞途徑在EMCV感染宿主細(xì)胞中的作用具有一定的科學(xué)價(jià)值及意義[14]。

圖8 Cytochalasin D作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV吸附的影響Fig.8 The impact of EMCV adsorb Hela cells dealt with Cytochalasin D

圖9 Cytochalasin D作用于Hela細(xì)胞對(duì)EMCV侵入的影響Fig.9 The impact of EMCV penetrate Hela cells dealt with Cytochalasin D

內(nèi)吞途徑作為病毒感染宿主細(xì)胞的途徑，根據(jù)主要功能蛋白和進(jìn)入途徑不同可以分為許多不同類型；本研究應(yīng)用可抑制所有內(nèi)吞途徑的抑制劑以及網(wǎng)格蛋白、大胞飲途徑和肌動(dòng)蛋白的特異性抑制劑來探究EMCV是否依賴于內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞，以及具體依賴于哪種內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞。首先筆者篩選了各種抑制劑不影響細(xì)胞活力的適合工作濃度，為了使試驗(yàn)數(shù)據(jù)更具有說服力，也為了減小試驗(yàn)的偶然誤差，本研究對(duì)每種抑制劑選擇兩個(gè)適宜濃度作用于細(xì)胞后接毒。胞內(nèi)病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果提示，內(nèi)吞途徑抑制劑NH4Cl和Bafilomycin A1可以抑制EMCV感染細(xì)胞，說明EMCV可通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入Hela細(xì)胞。然后用不同內(nèi)吞途徑抑制劑來探究EMCV具體通過哪種內(nèi)吞途徑進(jìn)入Hela細(xì)胞。由于網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑是經(jīng)典的內(nèi)吞途徑，本研究首先檢驗(yàn)網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlorpromazine和Pitstop作用后EMCV感染未受影響，說明EMCV不通過網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞。在非網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞途徑中，本研究檢測了巨胞飲途徑，結(jié)果同樣顯示EMCV感染Hela細(xì)胞不通過巨胞飲途徑。最后，檢測肌動(dòng)蛋白是否發(fā)揮作用，胞內(nèi)病毒蛋白、病毒滴度和病毒拷貝數(shù)檢測結(jié)果提示經(jīng)過肌動(dòng)蛋白抑制劑Cytochalasin D和Jasplakinolide作用后病毒感染受到抑制，最終證明EMCV可通過肌動(dòng)蛋白參與的內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，Cytochalasin D對(duì)病毒感染的抑制效果強(qiáng)于Jasplakinolide，針對(duì)這一現(xiàn)象筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Cytochalasin D和Jasplakinolide通過相反的機(jī)制抑制肌動(dòng)蛋白，Cytochalasin D可以抑制肌動(dòng)蛋白聚合；而Jasplakinolide可以抑制微絲解聚，使大部分肌動(dòng)蛋白以微絲的形式存在；這兩種藥物作用機(jī)制不同，對(duì)肌動(dòng)蛋白的抑制程度也不同，而且兩種抑制劑可以作用于細(xì)胞的濃度差異也較大，因此對(duì)病毒感染的抑制效果也不同，但試驗(yàn)結(jié)果的整體趨勢一致，都可抑制EMCV感染Hela細(xì)胞[15-16]。在接毒后90 min時(shí)，用免疫熒光法對(duì)EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP1和肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色，鏡下可見EMCV和肌動(dòng)蛋白有明顯共定位，同樣提示肌動(dòng)蛋白參與EMCV感染Hela細(xì)胞的過程。內(nèi)吞途徑與病毒感染宿主細(xì)胞的吸附和侵入過程有關(guān)，因此，本研究用肌動(dòng)蛋白抑制效果較好的特異性抑制劑Cytochalasin D探究肌動(dòng)蛋白是否在病毒的吸附與侵入過程中發(fā)揮作用，結(jié)果提示肌動(dòng)蛋白不參與EMCV的吸附過程，但在侵入過程中發(fā)揮作用。綜上所述，EMCV可通過肌動(dòng)蛋白參與的內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞。

本研究初步探索了內(nèi)吞途徑在EMCV感染宿主細(xì)胞中的作用，證明EMCV經(jīng)肌動(dòng)蛋白參與的內(nèi)吞途徑感染Hela細(xì)胞。這為臨床上防治EMCV及其他經(jīng)由肌動(dòng)蛋白參與的內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞的病毒提供一個(gè)思路。再者，隨著EMCV感染宿主細(xì)胞機(jī)制的研究不斷深入，有望從抑制肌動(dòng)蛋白方面入手，為預(yù)防和治療人與動(dòng)物的腦心肌炎提供更好的策略。