水環境中Ni2+對鯉魚鰓和肝臟的組織損傷

陳代宇，楊 飛，陳德芳，耿 毅

(1. 四川農業大學 動物科技學院，四川溫江 611130；2. 四川農業大學 動物醫學院，四川溫江 611130)

鎳(Nickel，Ni)是水環境中常見的污染物[1]，一部分來自地質風化的自然資源，一部分來自工業廢水排放、生活污水排放等人為活動[2]。水體Ni污染程度與沿岸污染源的分布密切相關，在工業集中地段及城市段的河流污染較嚴重，資料顯示長江上游[3]、海河河口[4]、珠江下游[5]和松花江[6]表層沉積物中Ni分別達到34.52 mg/kg、48.70 mg/kg、54.10 mg/kg和99.00 mg/kg，使周邊地區稻田水環境遭到Ni污染的可能性增加。雖然Ni是生物體不可缺少的微量營養素[7]，但有研究表明，過量Ni蓄積于生物體內也會具有潛在的致癌性[8]、基因毒性[9]和免疫毒性[10]等毒害作用。過量的Ni在水生生物體內富集會降低水生生物的呼吸作用、離子調節和抗氧化能力[11]。水環境中的Ni主要以鹵化物、硝酸鹽、硫酸鹽等形式溶于水，Ni2+在水環境中普遍存在，根據已有的研究報道，Ni2+對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)幼魚[13]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)和大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[14]的96 h LC50分別為0.33、0.79、3.83、3.84 mmol/L，并且可造成虹鱒[15]、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)[16]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[17]的鰓和肝臟組織損傷，而目前關于Ni2+對鯉魚組織的急性損傷還未見報道。

鯉魚是四川省內稻田養殖中常見的品種，養殖鯉魚具有成本低、收益大的特點[18]，水體中Ni2+濃度為0.003、0.005、0.008 mmol/L時，會影響鯉魚的游泳情況和呼吸頻率，從而使得存活率降低[19]，加劇經濟損失。但養殖水環境中Ni2+對鯉魚的急性致死濃度和急性病理損傷機理尚不清楚，因此通過急性毒性試驗明確Ni2+對鯉魚的安全濃度是非常必要的。本研究通過Ni2+對鯉魚的急性毒性試驗，明確Ni2+對鯉魚的安全濃度。并且在急性毒性試驗的基礎上，從組織病理學變化的角度初步研究水環境中Ni2+對鯉魚鰓和肝臟的急性損傷，以期為Ni2+對魚類的急性毒性和致病機理研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

600尾健康鯉魚全長 (4.50 ± 0.50) cm，體質量(2.57±0.52) g，購自四川浦江養殖場。暫養在實驗室(700×400×300) mm3的水族箱中，養殖水體的體積為40 L，水溫(22±1)℃，pH為6.5～7.0，待魚適應實驗室環境后開始試驗，試驗前禁食24 h。NiSO4·6H2O為分析純，成都市科龍試劑化工廠產品，在試驗前根據所需的Ni2+濃度進行配制。

1.2 急性毒性試驗

預試驗確定96 h內0%和100%鯉魚死亡的Ni2+濃度為0.55～1.25 mmol/L，設置1個對照組和7個試驗組，Ni2+濃度分別為0、0.55、0.62、0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L。將240尾魚隨機分到對照組和各試驗組中，每組30尾，水體體積為8 L，溫度和pH與暫養期間一致。參照王萬良等[20]、郭建波[13]的研究方法進行急性毒性試驗，試驗期間每24 h更換1次藥液，進行 96 h的臨床癥狀觀察并記錄死亡數量，根據各試驗組在各時間點的死亡數，用寇氏法計算Ni2+對鯉魚的96 h LC50[21]；并計算安全濃度(SC)，SC=96 h LC50× 0.01[2]。

1.3 鰓和肝臟的組織病理學觀察

基于急性毒性試驗的鯉魚死亡情況，設置1個對照組和5個試驗組，Ni2+濃度分別為0.72、0.83、0.96、1.09、1.25 mmol/L，將360尾魚隨機分到對照組和試驗組中，每組30尾，每組2個重復，其他處理同急性毒性試驗。對試驗魚進行連續96 h的臨床癥狀觀察，對每組瀕死魚進行剖檢，并收集鰓和肝臟，固定在φ=10%的中性福爾馬林溶液中。參照王國華等[22]、陳德芳[23]的方法進行組織切片和蘇木素-伊紅染色，通過光學顯微鏡觀察組織病理變化。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗

試驗期間，對照組(0 mmol/L)的鯉魚在整個試驗期間無死亡和任何異常現象。試驗組除 0.55 mmol/L組以外，其他組的鯉魚在試驗的 48 h內，都出現躁動、跳躍和鰓蓋活動加快的情況，并且濃度越高躁動情況越嚴重，48 h后，鯉魚表現為游動緩慢、反應呆滯；瀕死鯉魚的體表和鰓覆蓋大量黏液，魚體色變暗，鰓絲充血發紅，肝臟腫大充血。

在整個試驗期內，對照組和0.55 mmol/L組無鯉魚死亡，其余試驗組都有鯉魚死亡，死亡量隨Ni2+濃度升高而增多，值得注意的是，1.25 mmol/L組的鯉魚在試驗24 h內全部死亡(表1)。采用寇氏法算出96 h LC50為0.72 mmol/L，SC為0.007 2 mmol/L，表明Ni2+濃度高于 0.007 2 mmol/L的養殖水體對鯉魚有急性毒性。

表1 Ni2+對鯉魚的急性毒性試驗Table 1 Acute toxicity experiment of Ni2+ to carp

2.2 組織病理學研究

鰓組織切片觀察發現，對照組(0 mmol/L)鰓的組織結構完整，未見明顯病理變化，鰓小片結構正常，呼吸上皮細胞緊貼在鰓小片表面，毛細血管結構完整，血竇內紅細胞的數量、形態正常，柱狀細胞結構完整(圖1-A)。24 h內，高濃度試驗組 (1.25 mmol/L)的鯉魚全部死亡，鰓組織中大量的鰓小片呼吸上皮細胞壞死、脫落，毛細血管破裂，紅細胞溢出血竇(圖1-B)。48 h內觀察到中低濃度試驗組(0.72～1.09 mmol/L)鯉魚的鰓結構出現明顯變化，主要表現為鰓小片呼吸上皮水腫浮離，鰓小片融合，柱細胞結構遭到破壞(圖1-C，圖1-D)；72 h后，鰓的組織病理學變化主要表現為以血管反應為主的適應性病變，鰓小片內紅細胞充盈，血竇擴張，多個紅細胞重疊、堆積在血竇內(圖1-E，圖1-F)。結果表明水環境中Ni2+會對鯉魚的鰓造成急性損傷，高濃度試驗組(1.25 mmol/L)的鰓組織損傷以鰓小片呼吸上皮細胞壞死、脫落為主，中低濃度試驗組(0.72～1.09 mmol/L)的鰓組織損傷以鰓小片呼吸上皮水腫浮離、上皮細胞增生為主。

肝臟組織切片觀察發現，對照組(0 mmol/L)無明顯病理變化，肝細胞胞漿均質淡染，肝細胞排布緊密，細胞結構完整，細胞界限清晰，細胞核呈車輪狀，核仁清晰(圖2-A)。試驗期間，高濃度試驗組(1.25 mmol/L)的鯉魚24 h內全部死亡，肝臟組織血竇淤血，肝細胞腫大、細胞膜完整、分界清晰、細胞核固縮(圖2-B)。48 h內觀察到中低濃度試驗組(0.72～1.09 mmol/L)的鯉魚肝臟出現明顯的組織病理變化，肝血竇、中央靜脈淤血，肝細胞界限模糊、胞漿空泡化、細胞質深染，細胞核無明顯變化，肝臟組織局部區域細胞壞死(圖2-C，圖2-D)，72 h后，肝細胞胞質深染，肝臟局部區域出現空泡融合(圖2-E，圖2-F)。結果表明水環境中的Ni2+會對鯉魚的肝臟造成急性損傷，而高濃度試驗組(1.25 mmol/L)以細胞核固縮為主，中低濃度試驗組(0.72～1.09 mmol/L)以肝細胞空泡變性為主。

A.對照組鰓的組織結構 Gill tissue structure in the control group；B.1.25 mmol/L試驗組鰓組織的病理學變化 Gill histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L試驗組48 h內鰓的組織病理學變化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L試驗組48 h內鰓的組織病理學變化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group within 48 h；E.0.72 mmol/L試驗組72 h后鰓的組織病理學變化 Gill histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72 h；F.1.09 mmol/L濃度試驗組72 h后鰓的組織病理學變化 Gill histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；SL.鰓小片 Secondary gill lamella；REC.呼吸上皮細胞 Respiratory epithelial cells；PC.柱細胞 Pillar cell；ERY.紅細胞 Erythrocyte；LF.鰓小片融合 Fusion of the secondary lamellae；EH.上皮細胞增生 Epithelial hyperplasia；*.鰓呼吸上皮水腫浮離 Edema of the respiratory epithelium

圖1 鰓的組織病理變化(400×)
Fig.1 Histopathological changes of gill

3 討 論

Ni是一種普遍存在于自然界的微量金屬[24]，Ni也是生物體必需的微量元素[7]，但水環境中的Ni過量富集在水生生物體內會降低生物體的呼吸作用、離子調節和抗氧化能力[11]。Todorova等[19]將鯉魚暴露在Ni2+濃度為 0.003、0.005、0.008 mmol/L的養殖水體中，最初鯉魚表現為躁動、跳躍、快速游動等活動狀況，在48 h后躁動的魚體出現游動緩慢的現象，這些癥狀與本次急性毒性試驗的臨床癥狀相似。Chaudhry[25]研究發現條紋密鱸Colisafasciatus暴露在含有Ni2+的水環境中，其肝糖原和肌糖原儲存降低，血糖升高，但由于Ni2+對條紋密鱸的鰓造成了急性損傷，機體缺氧應激，使條紋密鱸在試驗24 h后血乳酸水平急劇升高，導致機體供能不足。本研究發現Ni2+也導致鯉魚鰓急性損傷，導致鯉魚缺氧應激。因此，本研究中48 h后由于機體缺氧、供能不足使鯉魚游泳緩慢、反應呆滯，鯉魚的鰓蓋活動加快，瀕死鯉魚的體表和鰓覆蓋大量黏液。Ni2+可以和魚體表黏液結合形成蛋白復合物，吸附在鰓和體表上，阻礙鰓和體表與水環境進行氧氣交換，導致魚體缺氧[26]，因此，鯉魚通過加快鰓蓋活動從而增加鰓絲與水環境中氧氣交換的頻率。

A.對照組肝臟組織結構 Liver tissue structure of the control group；B.1.25 mmol/L試驗組肝臟組織病理學變化 Liver histopathology changes of 1.25 mmol/L group；C.0.72 mmol/L試驗組48 h內肝臟組織病理學變化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group within 48 h；D.1.09 mmol/L試驗組48 h內鰓肝臟組織病理學變化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group with in 48 h；E.0.72 mmol/L試驗組72 h后肝臟組織病理學變化 Liver histopathology changes of 0.72 mmol/L group after 72h；F.1.09 mmol/L試驗組72 h后肝臟組織病理學變化 Liver histopathology changes of 1.09 mmol/L group after 72 h；PN.細胞核固縮 Pyknosis； BC.淤血 Blood congestion； VAC.空泡變性 Vacuolation； NEC.壞死 Necrosis；*.空泡融合 Vacuolar fusion

圖2 肝組織病理學變化(400×)
Fig.2 Histopathologicalchanges of liver

鰓是魚類呼吸、氮代謝廢物的排泄器官，也是維持滲透壓、離子穩態的主要部位[17,27]。鰓直接與水環境接觸，其組織結構易遭到水環境中污染物的破壞，從而導致離子穩態和滲透壓失衡[28]。本研究發現中低濃度試驗組(0.72～1.09 mmol/L)鯉魚的鰓小片呼吸上皮水腫浮離、細胞增生，鰓小片融合，當虹鱒[15]、鰱[16]和尼羅羅非魚[17]暴露于含有Ni2+的水環境中也觀察到相似的鰓組織損傷。已有研究報道鰓小片呼吸上皮浮離、細胞增生是魚類對水中污染物的適應性反應，這些組織變化增加水環境污染物與鰓組織內部結構之間的擴散距離，在不破壞鰓的正常生理功能的情況下，阻擋污染物進入鰓內部，防止污染物對鰓造成損傷[29]。但鰓呼吸上皮細胞過度水腫、增生會導致鰓小片融合，阻礙血液與水環境的氧氣交換，導致機體供氧不足，甚至導致魚體窒息死亡。本研究結果表明，高濃度試驗組(1.25 mmol/L)鯉魚的鰓急性損傷主要表現為鰓小片呼吸上皮細胞壞死、脫落，毛細血管壁破裂，高濃度的Cu2+會導致斑馬魚Daniorerio鰓出現相似的急性損傷[30]。高濃度的水環境污染物導致鰓小片呼吸上皮細胞壞死、脫落，嚴重影響鰓的正常生理功能，使血液與水環境的氧氣交換受阻。Ni2+進入鰓小片呼吸上皮細胞和毛細血管壁細胞后，誘導胞內活性氧自由基(ROS)增加，使細胞氧化應激，影響細胞的正常生理功能，誘導細胞壞死。并且ROS導致細胞膜磷脂過氧化，使細胞膜的功能和結構遭到破壞，從而導致毛細血管壁細胞破裂，紅細胞外流[31]。并且鰓在維持魚體離子平衡、滲透壓平衡上起著至關重要的作用，但有研究證明魚類暴露在重金屬污染的水環境中，鰓內的Na+/k+-ATP酶的活性受到抑制，導致離子穩態失衡，引起滲透壓改變[17]，進一步加快了細胞破裂的速度。

肝臟是各種新陳代謝途徑的重要器官，肝臟是糖原合成與分解的主要器官，脂質沉積的潛在場所，也是體內重金屬解毒的主要器官[32-33]。本研究發現鯉魚暴露在中低濃度(0.72～ 1.09 mmol/L)Ni2+污染的水環境中，其肝臟的組織結構發生明顯改變，Das等[34]用2.0 mg/100 g的NiSO4每隔1 d對鼠進行口服給藥，給藥10次后觀察到鼠肝臟的正常結構遭到破壞，細胞出現空泡化，這與本研究觀察到的結果相似。同樣的，Jayaseelan等[35]分別用0.002、0.17和0.17 mmol/L鎳納米顆粒對莫桑比克羅非魚Oreochromismossambicus進行為期14 d的處理，也觀察到莫桑比克羅非魚出現本研究中鯉魚相似的肝臟組織病理學變化：肝細胞界限模糊，肝細胞壞死，胞漿空泡化，細胞核固縮。據研究報道，Ni2+進入細胞內，導致細胞內的活性氧自由基(ROS)增加，細胞內的ROS可以誘導脂質過氧化，導致細胞生物膜系統的功能和結構遭到破壞[31,36]，因此，本研究中觀察到鯉魚肝細胞界限模糊。同時，Ni2+和ROS與DNA和組蛋白相互作用，導致DNA損傷，并且Ni2+會導致DNA修復酶的活性降低，使受損的DNA不能及時修復[31]，使肝細胞出現細胞核固縮的現象。據報道Hg2+會導致劍尾魚(Xiphophorushelleri)肝細胞線粒體腫脹和空泡增加，從而使肝細胞表現為空泡化[37]。本研究觀察到的鯉魚肝細胞空泡化可能也是由于Ni2+使鯉魚肝細胞線粒體腫脹和空泡增加導致，這還有待進一步驗證。此外，本研究中高濃度試驗組(1.25 mmol/L)的鯉魚在24 h內全部急性死亡。通過組織病理變化觀察發現，鯉魚在急性死亡的情況下其肝細胞損傷表現為細胞膜結構完整、細胞核固縮，這些病理變化與細胞凋亡的細胞形態相似，并且Liu等[38]研究證明Ni可以通過PI3K-Akt信號通路誘導細胞凋亡，關于Ni2+是否會導致鯉魚肝臟細胞的凋亡有待進一步研究。