新型抗菌肽DP7對大鼠骨髓間充質干細胞影響探討

任 靜，青 薇，鄭佳俊，黃 杰，彭湃然，牟雁東，2

(1.西南醫科大學口腔醫學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

炎癥引起的口腔疾病，如牙周炎，常常引起牙槽骨的吸收和結締組織的破壞。牙周炎是發生于牙支持組織的炎癥性感染性疾患，是口腔領域中兩大多發病之一，常引起牙槽骨吸收、牙松動甚至脫落，是破壞人類咀嚼器官的最主要疾病[1]。牙菌斑作為牙周炎發病的始動因子，在牙周炎的發生、發展中起著至關重要的作用。牙菌斑的致病性，主要是通過菌體內毒素、細酶及其釋放的的外毒素與細胞因子和代謝產物等直接破壞牙周組織，牙周致病菌的內毒素(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌的細胞壁成分，由菌體崩解后釋放而出，還能夠通過細菌抗原成分活化宿主的多種防御細胞，促進腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、核因子受體激活劑(RANKL)等因子的釋放，引發局部的免疫反應，導致牙周組織的繼發性損傷[2]。

抗菌肽(antibacterial peptide，AMP)廣泛存在于真菌、細菌、昆蟲、植物及動物體內，作為免疫系統的天然防線，對宿主抵抗外來生物入侵具有非常重要的意義[3]。此外，某些抗菌肽還具有免疫調節性能[4]，能夠趨化單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等向炎癥部位聚集，同時抑制LPS引起的炎癥反應[5]，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的產生，以及促進血管形成，促進受損區域組織愈合[6]。因此，在生物醫學領域，抗菌肽受到越來越多的關注，有望進一步開發與利用。本實驗擬使用的陽離子AMP DP7(VQWRIRVAVIRK)為四川大學國家重點生物實驗室自主研發的新型12-氨基酸亞梨子親水小分子抗菌肽，已證明其具有廣譜抗菌性、較好的生物相容性[7]，在體內外均能夠對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等產生良好的抑制效果，并能夠抑制LPS引起的TNF-α、IL-1β的釋放[8]。

骨髓間充質干細胞為骨組織損傷后修復的重要細胞，能夠分化為成骨細胞，進而形成新骨[9]。若新型陽離子抗菌肽DP7在具有良好抗菌性能的同時，能夠促進骨髓間充質干細胞成骨分化，將為牙周炎的臨床治療開辟新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料2019年1～5月，選擇4周齡清潔級SD雄性大鼠(由四川省人民醫院動物實驗中心提供)，體重(60.4±10.2)g；DP7(VQWRIRVAVIRK)由四川大學國家重點生物實驗室自主合成并純化；實驗試劑：胎牛血清(FBS)、DMEM 培養基、0.25%胰酶(Gibco，美國)、青霉素/鏈霉素-雙抗(Sigma，美國)、成骨誘導液(含5%胎牛血清，DMEM，10 nmol/ L地塞米松，10 mmol/ ml β-磷酸甘油鈉、50 μg/ ml L-抗壞血酸)，CCK-8試劑盒(FIUORESCENCE)，ALP試劑盒(南京建成，中國)，茜素紅S(Sigma，美國)等。本研究經四川省人民醫院倫理委員會批準[倫審(研)2018年第296號]。

1.2 方法

1.2.1細胞的分離和培養 4周齡清潔級SD雄性大鼠由7%水合氯醛麻醉，消毒，切開腿部皮膚和肌肉，鈍性分離后離斷大鼠股骨和脛骨，剪開股骨兩端的骨骺端，配比含有青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，反復沖洗骨髓腔，獲得細胞懸液。800 r/min離心5 min，棄上清，以1×106/ml的細胞濃度接種于培養皿中，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中，此時為P0代。原代培養5 d后進行全液換液，約達到80%融合時，0.25%胰酶消化，將其接種于新的培養皿，此時記為P1代，每3 d更換培養基，按照上述方法繼續傳代培養至P3代備用。

1.2.2CCK8檢測細胞增殖情況 取P3代骨髓間充質干細胞，已完成流式檢測，符合間充質干細胞的特性，可以納入后續實驗。收集細胞懸液，取1×104個細胞接種到96孔板中，每孔100 μl，共設置3個復孔，培養12小時。分別加入DP70、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/ml，分別處理4天后，每孔加入20 μl CCK8溶液，繼續培養4 h。向每孔中加入20 μl 終止液，立即混勻，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，吸光度值與細胞的增殖能力成正比。

1.2.3細胞劃痕檢測遷移能力 將對數生長期的細胞用胰酶消化后按一定細胞密度接入六孔板中。貼壁生長24 h時后，融合達到80%；在盤底用記號筆畫線作為標記，吸去培養液，用10 μl槍頭垂直于記號筆標記劃去盤中細胞；用PBS沖洗去除劃下的細胞，按照以上分組進行細胞處理。在0、24、48、72 h分別拍照，觀察細胞遷移情況。

1.2.4成骨誘導分化 待BMSCs生長增殖至80%融合時，收集細胞懸液，取2.5×104個細胞接種到24孔板中，37 ℃，體積分數5%CO2培養箱靜置培養過夜；第2 d移除孔板內原有培養液，換成骨誘導液(含5%胎牛血清，DMEM，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/mlβ-磷酸甘油鈉、50 μg/ml L-抗壞血酸)。各孔按照實驗分組分別加入0、32、48、64 mg/L DP7。后每3 d換液，至實驗設置的時間為止。

1.2.5ALP染色 誘導結束后，將各組細胞用4%多聚甲醛固定。移除孔板內培養基，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入400 μl 4%多聚甲醛，室溫15 min；PBS洗滌2次，每次3 min；配制反應工作液。取24 μl 25×NBT 加入到 0.6 ml 1×AP 反應緩沖液中，混勻后，再加入 24 μl 25×BCIP 混勻，即反應工作液；各實驗孔分別加入300 μl反應液，置37 ℃，1 h；移除反應液，加入去離子水終止反應；顯微鏡下拍照。

1.2.6茜素紅染色 誘導結束后，將各組細胞用70%乙醇固定。移除孔板內培養基，PBS洗滌2次，每次3 min，每孔加入400 μl 70%乙醇，室溫1 h；去離子水洗滌2次，每次3 min；各實驗孔分別加入300 μl 1%茜素紅染液，置37 ℃，20 min；移除反應液，加入去離子水終止反應；顯微鏡下拍照。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞形態學觀察鏡下觀察可見細胞開始呈長梭形呈旋渦狀生長，幾乎全部融合，大小形態均勻一致。見圖1。

圖1 BMSCs體外培養光鏡下形態學觀察(×40)

2.2 CCK-8檢測細胞活力0.05 mg/L抗菌肽組細胞細胞增殖能力與0 mg/L組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；其余各細胞細胞增殖能力低于0 mg/L組，差異有統計學意義(P< 0.05)，見圖2。

圖2 大鼠BMSCs細胞活力測試

與0 mg/ml組比較，***P< 0.001；**P< 0.01；*P< 0.05

0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/mL代表相應抗菌肽濃度處理組

2.3 細胞劃痕檢測遷移能力與0 mg/L抗菌肽組相比，16、32、48、64 mg/L抗菌肽組細胞遷移能力降低，且濃度增高，細胞遷移能力減弱；隨著時間的增加，細胞遷移能力增強。見圖3，圖4。

圖3 各組細胞不同時間點細胞劃痕相對距離百分比

圖4 不同濃度抗菌肽處理后細胞遷移能力(×100) a：0 mg/L抗菌肽組；b：16 mg/L抗菌肽組；c：32 mg/L抗菌肽組；d：48 mg/L抗菌肽組；e：64 mg/L抗菌肽組

2.4 不同濃度抗菌肽處理后細胞ALP染色不誘導組ALP含量很少；成骨誘導組中，0、16、32 mg/L抗菌肽組ALP含量較多，染色較深，64 mg/L抗菌肽組鈣結節含量較少，染色較淺。見圖5。

圖5 不同濃度抗菌肽處理后細胞ALP染色 a：不誘導組；b：成骨誘導+0 mg/L抗菌肽組；c：成骨誘導+16 mg/L抗菌肽組；d：成骨誘導+32 mg/L抗菌肽組；e：成骨誘導+48 mg/L抗菌肽組；f：成骨誘導+64 mg/L抗菌肽組(×100)

2.5 不同濃度抗菌肽處理后細胞茜素紅染色不誘導組無鈣結節形成；成骨誘導組中，0、16、32 mg/L抗菌肽組鈣結節含量較多，64 mg/L抗菌肽組鈣結節含量較少。見圖6。

圖6 不同濃度抗菌肽處理后細胞茜素紅染色 a：不誘導組；b：成骨誘導+0 mg/L抗菌肽組；c：成骨誘導+16 mg/L抗菌肽組；d：成骨誘導+32 mg/L抗菌肽組；e：成骨誘導+48 mg/L抗菌肽組；f：成骨誘導+64 mg/L抗菌肽組(×100)

3 討論

牙周病是口腔兩大主要疾病之一，晚期常常引起牙松動甚至脫落，是牙列缺損最主要的原因。臨床上常用齦上潔治、齦下刮治、根面平整等方法去除齦上下結石，但難以從根本上完全消除牙菌斑。四環素類藥物常常作為牙周炎的輔助藥物治療。然而，在治療的同時也會帶來其他的毒副作用，治療過程中為了保持足夠的需要濃度也會引起細菌的耐藥性。此外，普通抗生素也不具備促進成骨的效能。

抗菌肽作為天然免疫系統的第一道防線[3]，廣泛存在于各種動物、植物中，對宿主抵抗微生物入侵具有重要意義，在具有良好抗菌性的同時也不會產生耐藥性，成為最具潛力的抗菌藥物[10]。抗菌肽具有廣譜抗菌性，能夠對多種革蘭陽性菌、革蘭陰性菌具有殺滅作用，且不引起細菌耐藥性[11]，是最具有潛力的抗菌藥物之一，有望取代抗生素。Liu等[12]通過用MSCs和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠顱骨溶骨性骨缺損模型進行體外和體內研究，發現抗菌肽LL37顯著促進MSC細胞分化，遷移和增殖，還能體外抑制LPS誘導的破骨細胞形成和細菌活性。KRSR多肽涂層能很好的促進大鼠骨髓間充質干細胞粘附和成骨分化[13]。已有研究表明，抗菌肽LL-37具有免疫調節作用，能夠趨化抗炎因子如IL-1ra、IL-10等聚集到炎癥部位[12]；自組裝抗菌肽KLD-12既具備良好的抗菌能力，又能促進組織的快速愈合[14]；桿菌肽通過刺激骨形態發生蛋白-2/Smad軸促進骨髓間充質干細胞的成骨分化[15]；陽離子抗菌肽P15-CSP具有獨特的雙重能力抑制生物膜的形成，并作為親水性表面的涂層增強成骨活性[16]。本課題為了研究DP7是否也會對骨髓間充質干細胞成骨分化產生影響。

本實驗結果表明，高濃度的抗菌肽DP7對大鼠骨髓間充質干細胞增殖具有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加愈發明顯。但在100 mg/L濃度范圍以內，存活率均達80%以上，尚未造成大鼠BMSCs細胞活力的明顯影響。因此，后續實驗細化實驗濃度，采用0、16、32、48、64 mg/L濃度進行下一步實驗。細胞遷移實驗是反應細胞遷移能力的方法[17]，骨組織的損傷后修復依賴于成骨相關細胞的遷移，通過檢測劃痕變化反應骨髓間充質干細胞遷移能力的快慢。劃痕區域相對距離減短，說明細胞的遷移能力增加。劃痕實驗結果表明，隨著抗菌肽濃度的增加，細胞遷移能力逐漸減弱。經過查閱文獻及對DP7生產加工過程進行追溯，分析原因可能是由于抗菌肽生產過程中加入了某些具有細胞毒性的試劑，造成DP7對細胞具有一定毒性作用。

ALP為成骨細胞早期分化的標志物，其活性高低可以客觀反映成骨分化程度[18]。而鈣結節則是成骨細胞分化晚期的標志物，鈣結節的量客觀反映細胞成骨性能高低[19]。本實驗結果也說明抗菌肽DP7對大鼠骨髓間充質干細胞體外成骨性能具有一定的促進作用，且在32 mg/L濃度下作用最明顯，此濃度下，DP7既能夠使ALP活性增加，又能夠促進鈣化。這與理想效果下以劑量依賴的方式促進大鼠BMSCs成骨分化有所出入。原因可能是隨著共培養時間的增加，高濃度的DP7對大鼠骨髓間充質干細胞的毒性作用超過了成骨促進作用，造成大鼠BMSCs的凋亡。

考慮到本實驗中所用抗菌肽DP7控制感染的作用及促進成骨的潛力，制備出同時具有良好抗菌性能和促進成骨性能的新型實用抗菌肽意義重大。因此，下一步將對抗菌肽DP7進行進一步的改性，在保留其良好廣譜抗菌性的同時，降低其對細胞的毒性作用。