通腑湯對(duì)結(jié)腸吻合術(shù)后大鼠小腸推進(jìn)率及結(jié)腸組織中NO含量、iNOS活性的影響

張平 姚成禮 譚琰 姚貴賓

[關(guān)鍵詞]通腑湯;結(jié)腸吻合術(shù)后;大鼠小腸推進(jìn)率;結(jié)腸組織;NO含量;iNOS活性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.05.090

術(shù)后胃腸功能障礙（postoperative gastrointestinal?disorder，PGD）是胃腸動(dòng)力出現(xiàn)障礙的一種以非機(jī)械性梗阻為特征、胃腸排空障礙為主要表現(xiàn)的胃腸動(dòng)力紊亂綜合征。胃腸神經(jīng)功能平衡失調(diào)是其機(jī)制之一，胃腸電活動(dòng)減弱，平滑肌細(xì)胞收縮受到抑制，胃腸平滑肌處于舒張的相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，進(jìn)而產(chǎn)生腹脹、腸鳴音減弱或排便困難等，可進(jìn)一步發(fā)展為早期術(shù)后腸梗阻[1]。一氧化氮（nitric?oxide，NO）是由一氧化氮合酶（nitric?oxide?synthase，NOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生的氣體信號(hào)分子。NO作為非膽堿能非腎上腺神經(jīng)遞質(zhì)，在維持胃腸道正常運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，NO濃度的大小影響胃腸功能，與多種胃腸道疾病關(guān)系緊密，因此胃腸組織NO的含量可能是PGD發(fā)病的重要機(jī)制，因此該研究方向成為關(guān)注熱點(diǎn)。臨床上對(duì)PGD多以對(duì)癥治療，緩解癥狀為主，采用改善胃腸道微循環(huán)、維持胃腸道生態(tài)平衡等治療，雖然.針對(duì)性強(qiáng)，但措施單一、治療局限[2]。中醫(yī)治療PGD具有整體觀(guān)念和辨證論治的特色，從宏觀(guān)的角度多靶點(diǎn)、多途徑防治，臨床療效確切。通腑湯是北京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李乃卿教授多年治療PGD的經(jīng)驗(yàn)方。“理氣通腑，養(yǎng)血和血”是其治療原則，臨床療效顯著。前期研究證實(shí)，通腑湯可以提高腸肌電活動(dòng)、改善腸管收縮等途徑改善胃腸功能，發(fā)揮治療作用，但未從氣體信號(hào)分子層面進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究通腑湯對(duì)結(jié)腸吻合術(shù)模型大鼠小腸推進(jìn)率及結(jié)腸組織NO含量的影響，從氣體信號(hào)分子調(diào)節(jié)角度探討通腑湯治療術(shù)后胃腸功能紊亂的作用與機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料購(gòu)買(mǎi)SPF級(jí)SD大鼠30只，雄性，8周齡，體重200-250g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食水12h，按完全隨機(jī)法分對(duì)照組和通腑湯組，每組15只。

1.2藥物制備通腑湯藥物組成：大黃10g、枳實(shí)15g、厚樸15g、芒硝10g、川棟子6g、炒萊菔子12g、木香6g、烏藥10g、陳皮10g、半夏10g、當(dāng)歸10g、白芍12g，制備成含生藥量4.5g/kg的藥液。由北京中醫(yī)藥大學(xué)制備。所用中藥均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供的中藥配方顆粒。符合2015年版<中國(guó)藥典>的相關(guān)要求。中藥用量參照<中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)>按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量折算表計(jì)算，通腑湯中劑量給藥量為4.5g/kg。

1.3動(dòng)物模型按照0.33ml/100g稱(chēng)重，計(jì)算出各大鼠所需10%水合氯醛麻醉藥物劑量，于右下腹腔注射麻醉;檢查大鼠麻醉滿(mǎn)意后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，將下腹部暴露，不需提前剪毛，用組織剪在大鼠中下腹正中剪開(kāi)長(zhǎng)約2cm切口，找到盲腸下2cm處結(jié)腸，剪斷后原位一層縫合法縫合，腹膜和肌層連續(xù)縫合，間斷縫合皮層。術(shù)后大鼠背部皮下注射2萬(wàn)IU/kg青霉素G鈉和250mg/kg硫酸鏈霉素，連續(xù)3d;術(shù)后48h內(nèi)禁食不禁水，早晚分別灌胃20%葡萄糖溶液2次，間隔8h，第3天灌胃飼料糊20ml/kg（標(biāo)準(zhǔn)飼料超微粉碎，配制20%飼料糊），第4天自由飲食。

1.4實(shí)驗(yàn)方法術(shù)后6h開(kāi)始干預(yù)，通腑湯組大鼠以4.5gkg劑量灌胃，灌服藥物劑量根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人相同體表面積折算，即200g大鼠所需劑量相當(dāng)于成人量（70kg）x0.018，然后通腑湯組大鼠予通腑湯4.5ml/kg灌胃治療，對(duì)照組給予等體積溫水4.5ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)7d。末次給藥后24h，實(shí)驗(yàn)大鼠均用碳素墨水按1ml/只的劑量灌胃，30min后處死。.1.5標(biāo)本采集取大鼠結(jié)腸手術(shù)部位組織，冰凍0.9%氯化鈉（NaCI）溶液漂洗。用濾紙快速吸干，按重量（g）：體積（m）為1：9的比例加0.9%NaCl溶液制成10%的組織勻漿液，低溫3000r/min離心15min，取上清液置于-209待測(cè)。

1.6檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1小腸推進(jìn)率測(cè)定小腸推進(jìn)率=幽門(mén)至碳末前端的距離+小腸全長(zhǎng)x100%。操作：將幽門(mén)至回盲部的小腸，放人測(cè)量容器中，測(cè)量墨水在腸管內(nèi)的移動(dòng)的距離和小腸全長(zhǎng)。

1.6.2結(jié)腸組織NO含量測(cè)定NO含量（umol/g）=[（測(cè)定管吸光度一空白管吸光度）+（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度一空白管吸光度）]x標(biāo)準(zhǔn)品濃度（20umol/g）x樣本的蛋白含量（g/L）。操作：依據(jù)試劑盒配制標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明，測(cè)定管內(nèi)滴加樣本、相關(guān)試劑，于37C水浴60min，再加入滴試劑混勻離心，取上清加顯色劑，在調(diào)至550nm波長(zhǎng)的多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行比色。

1.6.3結(jié)腸組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS活性測(cè)定NOS活力（U/mg）=[（測(cè)定管吸光度一空白管吸光度）/呈色物納摩爾消光系數(shù)]x（反應(yīng)液總體積/取樣量）+（比色光徑x反應(yīng)時(shí)間）+蛋白含量（mg/L）。操作：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將試劑加人測(cè)定管混勻，于37C水浴15min，再加透明劑、終止液混勻，蒸餾水調(diào)零，在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度OD值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，作方差齊性和正態(tài)性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足方差齊性以one-way?ANOVA法進(jìn)行方差分析，不滿(mǎn)足方差齊性則以非參數(shù)法檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠小腸推進(jìn)率比較通腑湯組大鼠的小腸推進(jìn)率為（76.28±5.60）%，顯著高于對(duì)照組的（59.32±7.54）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

2.2兩組大鼠結(jié)腸組織NO含量比較通腑湯組大鼠的結(jié)腸組織NO含量（5.30±1.12）umol/g明顯低于對(duì)照組的（18.34±2.11）umol/g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

2.3兩組大鼠結(jié)腸組織iNOs活性比較通腑湯組大鼠的結(jié)腸組織iNOs活性（10.55±1.41）umol/g明顯低于對(duì)照組的（19.56±4.32）umol/g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3，圖3。

3討論

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enterie nervous?system，ENS）是調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，使消化系統(tǒng)功能正常運(yùn)行的三大神經(jīng)系統(tǒng)之一。NO在胃腸道分布廣泛，是NOS的產(chǎn)物，是ENS主要的非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)。通過(guò)非傳統(tǒng)接頭后功能受體活化可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（sGC），然后將三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）分解生成環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP），激活蛋白激酶G，降低Ca2+敏感性和激活K*通道[3]，進(jìn)而發(fā)揮抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的作用，抑制胃腸動(dòng)力，延緩胃排空。然而NO具有細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞毒性的雙重效應(yīng)。生理?xiàng)l件下，NO作為一種內(nèi)源性介質(zhì)調(diào)節(jié)組織的修復(fù)及其完整性。由于NO沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的儲(chǔ)存及釋放調(diào)節(jié)機(jī)制，靶細(xì)胞上NO的多少直接與NO的生成量有關(guān)。iNOS是產(chǎn)生NO的主要合成酶，生理?xiàng)l件下iNoS并不表達(dá)，在應(yīng)激和炎性反應(yīng)情況下，巨噬細(xì)胞和腸平滑肌細(xì)胞生成大量的iNOS[4]，產(chǎn)生高濃度NO，并與超氧陰離子結(jié)合成亞硝酸陰離子，并質(zhì)子化形成具有強(qiáng)氧化性的過(guò)氧亞硝酸，蛻變?yōu)樽杂苫ㄟ^(guò)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)導(dǎo)致含巰基蛋白和脂質(zhì)過(guò)氧化，造成組織細(xì)胞損傷。因此，胃腸道的許多病理過(guò)程與高濃度的NO有關(guān)[5]。

中醫(yī)對(duì)PGD的辯證分型目前尚未統(tǒng)一。李乃卿教授認(rèn)為腹部手術(shù)擾亂了體內(nèi)正常的氣機(jī)運(yùn)行，損耗胃腸氣血，肝氣失于疏泄，脾胃失于運(yùn)化，腑氣壅塞不暢而發(fā)病。氣血虧虛為本，氣滯血瘀、腑氣不通為標(biāo)。確立了“理氣通腑，養(yǎng)血和血”的治療原則。創(chuàng)立有獨(dú)特療效的經(jīng)驗(yàn)方一通腑湯[6]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠行結(jié)腸吻合術(shù)，引起大鼠結(jié)腸組織中NO含量和iNOS活性升高，造成大鼠胃腸功能減弱，胃腸排空障礙。觀(guān)察術(shù)后盡早給與大鼠通腑湯灌胃對(duì)小腸推進(jìn)率及結(jié)腸組織中NO含量和iNOS活性的影響。研究表明，與對(duì)照組相比通腑湯組大鼠小腸推進(jìn)率顯著增大，結(jié)腸組織中NO含量及iNOS活性明顯升高。

綜上所述，通腑湯通過(guò)抑制iNOS活性，減少NO產(chǎn)生和釋放發(fā)揮重要作用，從而促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，治療術(shù)后胃腸功能紊亂。

參考文獻(xiàn)

[1]姜勇，汪欣，萬(wàn)遠(yuǎn)廉，等.111例結(jié)腸癌伴發(fā)急性腸梗阻術(shù)后并發(fā)癥危險(xiǎn)因素分析.中華胃腸外科雜志，2011，14（1）：48-51.

[2]韓雙雙，牟園芬.中西醫(yī)結(jié)合防治危重癥患者胃腸功能障礙的研究進(jìn)展.中醫(yī)臨床研究，2018，10（17）：145-148.

[3]Bian K， Murad F. sGC-cGMP signaling： target for anticancer therapy. Springer New York， 2014， 814（814）：5-13.

[4]Eskandari MK， Kalff JC， Billiar TR， et al. LPS-in-duced muscularis

macrophage nitric oxide suppresses rat?jejunum circular muscle?activity. Am J Physiol， 1999， 277（2 pt 1）：G478-G486.

[5]王李，高羽，童衛(wèi)東，等.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶與Cajal間質(zhì)細(xì)胞在術(shù)后腸梗阻大鼠小腸中的表達(dá)及意義.中華消化外科雜志，2012，11（4）：382-385.

[6]田明，孫清露，陳振宙，等.經(jīng)空腸注人通腑湯對(duì)重癥急性胰腺炎患者胃腸功能的影響及機(jī)制研究.中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2018（3）：291-293.

[收稿日期：2019-09-29]