AKR1B10基因沉默對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

錢瑞坤， 馬長林， 喬 森

濟寧市第一人民醫院 肝膽外科， 山東 濟寧 272100

肝細胞癌(HCC)是肝臟中最常見的惡性原發性腫瘤，也是全球癌癥死亡的第二大主要原因。已發現醛酮還原酶家族1成員B10(aldo-keto reductase family 1 member B10，AKR1B10)在HCC、非小細胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌中高表達[1-4]。

AKR1B10是醛酮還原酶(aldo-keto reductase，AKR)超家族的一員，AKR是一種以NADPH為輔酶的氧化還原酶基因超家族，可催化醛酮類物質轉化為相應的醇。AKR在不同的生物體內可參與多種生物學過程，包括羰基解毒、滲透調節、激素代謝、脂質合成、腫瘤的發生與治療[5]。AKR1B10在人類肝癌中高表達，但其調控機制仍不明確。為了解AKR1B10在肝癌中的致癌作用，本研究使用shRNA敲減方法進一步分析了AKR1B10沉默對肝癌生物表型的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 HepG2及Huh7 HCC細胞株均在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 g/ml)的DMEM培養基中培養，放置于37℃、含有5%CO2的恒溫培養箱中。

1.2 AKR1B10敲減 將1×105Huh7及HepG2 HCC細胞接種在裝有2 ml新鮮完全培養基的6孔板中。過夜孵育后，除去培養基，加入2 ml含shRNA-AKR1B10慢病毒顆粒的培養基(含10 μg/ml polybrene)。24 h后，除去含有病毒的培養基，每孔加入2 ml新鮮完全培養基(DMEM+10%胎牛血清)。48 h后，用含有1 μg/ml嘌呤霉素的培養基篩選陽性細胞。

1.3 AnnexinV-APC/PI雙染法檢測細胞凋亡 穩轉shRNA-scramble的HepG2及 Huh7細胞(對照組)及敲減AKR1B10的HepG2及 Huh7細胞(敲減組)消化后，收集5×105個細胞，AnnexinV-APC和PI(Abnova)染料雙染，利用流式細胞儀(BD Biosciences)進行檢測，具體的實驗步驟參考試劑盒說明書。

1.4 克隆形成實驗 取對數生長期的細胞，用胰酶消化后計數。在6孔板里進行，每孔鋪種Huh7細胞2000個，每孔2 ml培養液 (DMEM+10% FBS) 于培養箱中進行培養，每3天更換1次培養液，培養10 d左右，棄培養液，用預冷的PBS洗滌2次之后，甲醇固定15 min，再用結晶紫染色10 min。在鏡下計數，≥50個細胞形成的細胞團即為一個克隆。

1.5 檢測活性氧(ROS) 使用過氧化物敏感性熒光探針DCFH-DA檢測細胞內ROS的產生。 將細胞鋪在6孔板中，然后使用無血清的DMEM將DCFH-DA的終濃度調整為20 μmol/L，每孔加入1 ml DCFH-DA稀釋液，37 ℃孵育30 min，并用PBS洗滌3次。ROS水平通過流式細胞儀(BD Biosciences)測定。

1.6 患者肝癌組織及異體移植瘤模型 肝癌組織來自本院肝膽外科2018年1月-2018年6月收治的6例肝癌患者。本研究通過濟寧第一人民醫院倫理委員會審批[批號：2018倫審研第(017)號]及實驗動物倫理委員會審批[批號：2018倫審研第(045)號]，所有患者均簽署知情同意書。實驗中使用了4～6周齡的BALB-c/Nude小鼠，購自上海南方模式生物科技股份有限公司。將AKR1B10敲減組以及對照組的Huh7細胞皮下注射到BALB-c/Nude雌性小鼠的左下肢(每只小鼠100 μl細胞懸液，包含4×106個細胞)。注射后第7天開始，每3天記錄1次腫瘤體積。

2 結果

2.1 AKR1B10在HCC細胞和HCC組織中的表達 CCLE數據庫提示AKR1B10 mRNA在HCC細胞中的表達明顯高于正常肝細胞(https://portals.broadinstitute.org/ccle)(圖1a)。Oncomine數據庫中的數據顯示，與癌旁組織(n=220)相比，HCC組織(n=225)中AKR1B10 mRNA的表達增加了10倍以上(圖1b)。使用UALCAN數據庫分析了HCC轉錄組數據，提示AKR1B10 mRNA在HCC組織中高表達(圖1c)。同時，本研究在6例HCC患者中檢測到AKR1B10在HCC組織中的表達高于癌旁組織(圖1d)。

2.2 AKR1B10沉默對HCC細胞克隆、凋亡的影響 與對照組細胞相比，AKR1B10敲減的Huh7和HepG2細胞(使用不同的慢病毒敲減Huh7和HepG2細胞中的AKR1B10基因，分別標記為1#和2#)中AKR1B10的表達水平顯著下調(P值均<0.01)(圖 2a)。與對照組相比，敲減組中觀察到細胞集落形成的能力顯著下降(P值均<0.001)(圖2b，表1)。在AKR1B10敲減的情況下，肝癌細胞的凋亡率顯著增加(P值均<0.001)(圖2c，表1)。Western Blot表明，AKR1B10敲減后導致凋亡相關蛋白(包括剪切后的Caspase-3和RARP)的表達增加(圖3a)。

表1 敲減AKR1B10后HCC細胞克隆和凋亡的情況

注：與對照組比較，1)P<0.001。

2.3 AKR1B10敲減通過ROS超載引起廣泛的DNA損傷 如圖3b所示，AKR1B10敲減組細胞的ROS水平高于對照組。為了研究敲減AKR1B10的HCC細胞中升高的ROS水平是否引起DNA損傷，通過Western Blot檢測γ-H2AX和p-ATMser1981的水平以確定DNA損傷的存在。結果顯示，AKR1B10敲減可以導致p-ATMser1981和γ-H2AX的累積(圖3a)。

注：a，CCLE 數據庫中HCC細胞系中AKR1B10 mRNA水平； b，Oncomine數據庫中癌旁組織與HCC組織的AKR1B10 mRNA水平； c，UALCAN數據庫中HCC組織與癌旁組織的AKR1B10mRNA表達水平； d，Western Blot評估AKR1B10在本研究6例HCC患者癌旁組織(P)和癌組織(T)中的表達。

圖1AKR1B10在HCC中的表達情況

2.4 AKR1B10敲減可延遲腫瘤發生，降低HCC異種移植小鼠的腫瘤體積 將AKR1B10敲減組以及對照組的Huh7細胞皮下注射到BALB-c/Nude雌性小鼠的左下肢，28 d后拍照并剝離瘤體，如圖 4a～b 所示，AKR1B10敲減的HCC細胞致癌能力減弱，腫瘤體積減少。從異體移植后第13天開始，與對照組相比，AKR1B10敲減組腫瘤體積明顯縮小(P值均<0.05)(圖4c)。對照組瘤體石蠟包埋后，HE染色如圖4d所示。

注：a，Western Blot 檢測 AKR1B10敲減組細胞中AKR1B10蛋白水平； b，敲減組Huh7細胞集落形成的結果； c，流式細胞分析法檢測敲減組HepG2 以及Huh7 細胞的凋亡。

圖2敲減AKR1B10對HCC細胞克隆、凋亡的影響

3 討論

肝癌是全球第五大最常見的癌癥，已證實對公共健康構成嚴重威脅[6]。盡管當前的治療策略在過去幾十年中已有所改善，但長期生存率仍不令人滿意[7]。AKR1B10在HCC中過表達，在相鄰的肝組織中幾乎沒有表達。 HCC細胞中AKR1B10表達的沉默導致:(1)HCC細胞集落形成減少、細胞凋亡增加；(2)HCC細胞內氧化應激和DNA損傷增強；(3)延遲腫瘤發生和體內腫瘤負荷減少。這些結果均說明AKR1B10參與HCC的發生和發展。

為了闡明AKR1B10在HCC中的調控機制，筆者在GCBI網站(www.gcbi.com.cn)上預測AKR1B10參與多種代謝途徑，包括戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化、果糖和甘露糖代謝、半乳糖代謝、甘油脂代謝、丙酮酸代謝。

注： a，流式細胞技術檢測AKR1B10敲減引起的細胞內ROS變化(空白組為Huh7細胞不與DCFH-DA共孵育，H2O2為陽性對照組)； b，Western Blot檢測AKR1B10敲減的HCC細胞中DNA損傷和細胞凋亡相關蛋白表達水平。

圖3AKR1B10沉默后誘導ROS超載

AKR1B10可能通過調節相關代謝在腫瘤發生中起關鍵作用。前期研究[8-10]已經報道了由于代謝過程中ATP耗竭引起ROS升高會導致癌細胞的凋亡增加。筆者推測，由AKR1B10敲減引起的ROS超負荷可能導致HCC細胞內的DNA發生氧化損傷。本研究中，通過DCFH-DA探針檢測發現AKR1B10敲減可誘導細胞ROS積累，從而導致DNA損傷。ATM是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調節細胞周期檢查點控制、細胞凋亡和DNA修復[11]。在暴露的DNA雙鏈斷裂應力下，ATM在ser1981位點被自身磷酸化激活。γ-H2AX是一種變異的組蛋白，可響應DNA雙鏈斷裂而在ser139處被磷酸化激活，從而在斷裂點處形成病灶[12]。HCC細胞系中p-ATMser1981和γ-H2AX的增加更加確定了筆者的推論。據報道，與正常細胞相比，癌細胞的ROS水平較高[13]。穩定的ROS水平還可以充當化學信使，激活NF-κB和p38 MAPK等信號通路，從而影響細胞增殖、分化和凋亡[14]。AKR1B10的高表達可以在HCC中維持相對穩定的ROS水平。推測敲減AKR1B10引起異常代謝，然后增加氧化應激和廣泛的DNA損傷，導致細胞死亡。

綜上，本研究證明AKR1B10減少了氧化應激超負荷和DNA損傷，從而促進了HCC的發生和發展。AKR1B10是預后不良的有前途且具有高度潛力的生物標志物。基于這些發現，AKR1B10是否為HCC的潛在新治療靶標有待于進一步驗證。

注：a～b，異體移植shRNA-AKR1B10和對照組小鼠的腫瘤體積情況； c，腫瘤生長曲線(與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；d,Huh7皮下成瘤后的HE染色結果(×200)。

圖4敲減AKR1B10后異體移植HCC細胞成瘤體積的變化