白芨塊莖cDNA文庫構建及轉錄組序列分析

王 宇，楊文麗，李嘉鈺，向雪靜，李月萍，蔡佳麗

（1.攀枝花學院附屬醫院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花學院醫學院，四川攀枝花617000）

白芨是多年生草本植物，屬于蘭科白芨屬。主要分布在云南、四川、貴州、湖南、湖北、江西等省，多生長在海拔高度為950-3500 m的闊葉林下。白芨及其塊莖是我國藥典記錄的傳統中藥材之一，最早在《神農本草經》中就有記載，其塊莖中含有較豐富的芐類、萜類和多糖類化學成分，具有止血潤肺、消腫生肌、抗氧化、清除自由基、預防心血管疾病、抗菌和抗腫瘤等功效，在醫藥食品等領域已廣泛應用［1-4］。

目前，通過構建cDNA文庫和高通量轉錄組測序，已對多種藥用植物進行分子生物學研究，挖掘出了一些重要功能基因，對于揭示不同生物學性狀的分子機制具有重要意義［5］。

本研究采用高通量測序技術對白芨塊莖進行轉錄組分析，得到白芨的重要功能基因，對其進行功能注釋、分類和代謝通路分析，這為下一步研究白芨的藥用成分、次生代謝等機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料

植株由攀枝花市豐盛源農林開發有限公司提供。

1.1.2主要儀器與試劑

凝膠成像系統和電泳儀購于美國伯樂公司、超微量核酸分析儀購于杭州奧盛儀器有限公司、RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1RNA提取

按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA，使用凝膠電泳和超微量核酸分析儀對其質量和濃度進行分析。

1.2.2cDNA文庫的構建

首先用磁珠富集poly（A）mRNA，然后以mRNA為模板，經逆轉錄反應合成第一鏈cDNA和第二鏈cDNA，對雙鏈cDNA進行純化后再進行末端修復、加尾和加接頭，片段分選以及PCR擴增，最后構建成cDNA文庫，對文庫質檢后進行測序。

1.2.3生物信息學分析

對測序得到的原始數據用生物信息學軟件進行處理，得到有效數據（Unigene序列），再將獲得的Unigene序列與SwissProt、Nr、GO、KEGG和COG數據庫進行比對，獲得功能注釋，推測基因的功能與作用。

2 結果

2.1 轉錄組組裝分析

測序得到5624755條序列，經過組裝得到130721條Unigene，N50長度為1490 bp，最短序列長度為201 bp，最長序列長15579 bp，平均長度為802 bp。在130721條Unigene中，76239條在200-500bp之間，占58.32%；21645條在500-1000 bp之間，占16.56%；11919條在1000-1500bp之間，占9.12%；8234條在1500-2000 bp之間，占6.30%；12683條大于2000bp，占9.70%（圖1）。

圖1 Unigene不同長度區間分布

圖2 Unigene在各數據庫注釋分布

2.2 Unigene注釋

將130721條Unigene序列通過NR、COG、Swissprot、KEGG等數據庫進行比對，60827條Unigene獲得注釋。60033條Unigene在NR數據庫中獲得注釋，占45.92%，30267條Unigene在COG數據庫中獲得注釋，占23.15%；39368條在Swissprot數據庫中獲得注釋，占30.12%；8252條在KEGG數據庫中獲得注釋，占6.31%，見圖2。

2.3 Unigene的GO分類

25820條Unigene得到GO功能注釋，共分為54個小類，其中生物進程、有19個小類，主要有：信號轉導、細胞調控、細胞自噬、生物調控、刺激反應、繁殖進程等；分子功能有22個小類，主要有：結構分子活性、運輸活性、催化活性、營養儲存活性、抗氧化活性、與蛋白質結合的轉錄因子活性、分子功能調控等；細胞組分有13個小類，主要有：細胞膜、突觸部分、細胞外基質、大分子復合體等。

2.4 Unigene的COG分類

COG數據庫是由NCBI創建并維護的蛋白數據庫，通過比較大量生物的蛋白質序列對基因產物進行同源分類。將Unigene通過COG數據庫后進行分類，可以分為RNA加工和修飾、細胞周期控制、防御機制等不同功能，詳見圖3。

圖3 Unigene的COG功能分類

2.5 Unigene的KOG分類

30267條Unigene得到GO功能注釋，可分為26類；其中參與“一般功能預測”（General function prediction only）的轉錄物最多，有4286個，占 14.16%；第二為參與“信號傳導機制”（Siganl transduction mechanisms）的轉錄物，有3733個，比例為12.33%。此外，還包括核酸運輸代謝、RNA組裝修飾、糖類運輸代謝、輔酶運輸代謝、脂類運輸代謝、能量生產轉化等多數生理生化過程。

2.6 KEGG代謝分析

KEGG代謝途徑分析表明，1916條Unigene參與了葡萄糖、果糖、半乳糖等多種糖類代謝，1320條Unigene參與了多種氨基酸代謝；185條Unigene參與了萜類和酮類化合物的代謝，此外，參與脂類、核酸、能量等代謝類型的Unigene有9194條；1147條Unigene參與了各種細胞和組織系統（如運輸與分解代謝）進程，4259條Unigene參與了遺傳物質（如折疊、分類和降解）和環境信息（如信號轉導）的處理和加工過程。

2.7 白芨多糖的關鍵酶

白芨膠質的主要成分為白芨多糖，以葡萄糖和甘露聚糖為主，找到相關合成的酶基因，有利于闡明白芨膠質多糖的生物合成與分解途徑。本研究發現了有關白芨多糖合成的多個酶基因，如β-葡萄糖苷酶、β-葡糖醛酸基轉移酶、α-甘露糖苷酶、磷酸異構酶、6-磷酸果糖激酶等，這些酶基因都參與了糖代謝途徑。

2.8 微衛星DNA序列分析

微衛星DNA序列就是簡單重復序列，廣泛分布于真核生物的基因中，可以作為優良的遺傳標記。在白芨中發現39585個星位點，以單核苷酸、雙核苷酸和三核苷酸三種類型為主，單核苷酸的基序為A/T/C，二核苷酸基序為AT/AG/CT，三核苷酸的基序為TTC/ATC/CGG。

3 討論

白芨塊莖含有豐富的多糖，具有誘導免疫調節因子表達、增強天然殺傷性細胞活性等免疫功能，因此可以開發為抗腫瘤藥物或者化妝品添加物［6］。此外，白芨塊莖中含有萜類、甾類以及聯芐類物質，研究表明白芨萜類及其衍生物具有抗血管生成，誘導血管內皮細胞凋亡的作用。目前，將白芨的化學成分和藥理研究結合起來，對研制新藥具有廣闊的應用前景［7］。

本研究通過對白芨的轉錄組進行分析，找到了大量參與白芨多糖和萜類合成與代謝相關的基因，這為研究白芨的藥用成分、次生代謝具有重要意義。同時，通過對微衛星DNA序列分析可為白芨的遺傳多樣性和分子標記輔助育種奠定基礎。