乙型肝炎患者治療過(guò)程中血清USP7、IL-6、TNF-a的動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)性研究

馬玉 張咪 王雪

摘要 目的：初步探討泛素特異性蛋白酶7（Ubiquitin-specific proteases7，USP7）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）在乙型肝炎患者血清中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與肝功指標(biāo)的相關(guān)性。方法：收集不同時(shí)間點(diǎn)乙型肝炎患者的血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)98例乙型肝炎患者入院治療前和治療1w、2w、3w、4w血清中USP7、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，并分析USP7及炎癥因子與肝功指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：USP7在乙型肝炎患者治療過(guò)程中呈現(xiàn)規(guī)律變化，并且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)水平逐漸下降，且治療1w、2w、3w、4w后血清USP7、IL-6、TNF-α與治療前相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。USP7蛋白表達(dá)量與IL-6、TNF-a的表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：USP7可能參與乙型肝炎的發(fā)展進(jìn)程，并且與乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝臟炎性損傷有一定聯(lián)系。

關(guān)鍵詞 USP7;乙型肝炎;炎癥

中圖分類號(hào)? R512.62? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? B? ? 文章編號(hào)? 1671-0223（2020）02-029-04

Abstract? ?Objective To survey the dynamic changes of USP7， IL-6 and TNF-α in serum of patients with hepatitis B and its correlation with ALT and AST. Methods The expression of USP7，IL-6，TNF-α detected by ELISA and liver function indicators correlation. Results USP7 showed regular changes during the treatment of hepatitis B patients， and with the prolongation of treatment time， the protein expression level gradually decreased， and serum USP7， IL-6， TNF-α， ALT， AST， etc. after 1w， 2w， 3w， 4w treatment There were significant differences between the two groups （P <0.05）. The expression of USP7 protein was positively correlated with the protein expression of ALT， AST and IL-6， TNF-α （P <0.05）. Conclusion USP7 may be Participate in the development of hepatitis B and have a certain relationship with liver inflammatory damage caused by hepatitis B virus infection.

Key words USP7; Hepatitis B; Inflammation

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的以肝臟慢性炎性損傷為主的傳染病[1，2]。目前，HBV已呈世界性大流行，我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)，其慢性炎癥引起的肝炎后肝硬化、乙型肝炎相關(guān)肝癌更是不容小覷[3]。因此，有效的監(jiān)測(cè)乙型肝炎的發(fā)展并及時(shí)給予干預(yù)措施顯得尤為重要。

近年來(lái)，在肝病的機(jī)制研究中，表觀遺傳因素受到了越來(lái)越多的關(guān)注。其中，蛋白的泛素化、去泛素化是表觀遺傳的重要組成部分，且在肝病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用[4，5]。這為乙型肝炎的研究提供了新的視角。泛素特異性蛋白酶（USPs）是構(gòu)成去泛素化酶的最大亞家族，它是從特定蛋白質(zhì)底物中去除泛素，以防止它們被靶向蛋白酶體降解的一種去泛素化酶[4，5]。作為USP家族的一員，USP7（與皰疹病毒相關(guān)的USP，HAUSP）是一種進(jìn)化上保守的蛋白，最初被認(rèn)為是單純皰疹病毒蛋白Vmw110的結(jié)合配偶體，同時(shí)也為細(xì)胞生長(zhǎng)控制，細(xì)胞周期調(diào)控，受體功能，發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)所必需[6]。近期有研究表明，USP7在HBV相關(guān)肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]，還有研究表明，USP7與炎癥信號(hào)通路NF-κB相互作用[5]且NF-κB可以調(diào)控多種炎癥因子，而在HBV感染狀態(tài)下，T細(xì)胞是清除細(xì)胞內(nèi)病毒最主要的效應(yīng)細(xì)胞。T細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如：IL-6、TNF-a等，在HBV的免疫應(yīng)答中起核心作用。因此，我們推測(cè)，USP7在乙型肝炎的進(jìn)程中起著一定的作用。

本研究對(duì)乙型肝炎患者治療不同階段的血清USP7及炎癥相關(guān)因子進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以期為預(yù)防HBV導(dǎo)致的肝損傷進(jìn)一步惡化提供證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年8月-2018年12月在石家莊市第五醫(yī)院被診斷為乙型肝炎的住院患者作為觀察對(duì)象，共98例，其中男性71例，女性27例。入組患者的臨床資料及肝功指標(biāo)由石家莊市第五醫(yī)院檢查記錄或問(wèn)卷調(diào)查獲得。所有患者均簽訂知情同意書。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)[8]

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）診斷標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：孕產(chǎn)婦;除HBV外的其他病毒感染者;合并其他類型肝病的患者;合并嚴(yán)重代謝性、免疫性疾病;近1個(gè)月內(nèi)有輸血史者等[8]。

1.3 問(wèn)卷調(diào)查[8]

收集研究對(duì)象的一般資料（性別、年齡、民族、吸煙、飲酒等）抗病毒治療方案、個(gè)人病史及用藥史等。

1.4 血標(biāo)本處理[8]

收集每個(gè)納入患者入院治療前第一份靜脈血1.5mL，治療1w、2w、3w、4w后靜脈血1.5mL，12000rpm離心5min，取上清于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA法檢測(cè)USP7及IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平[8]

試劑盒由北京安迪華泰科技有限公司提供，試劑盒室溫平衡20 min后取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，樣本孔加細(xì)胞上清液10 μL同時(shí)加入40 μL樣本稀釋液，各孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP），封板膜封住，37 ℃溫育后，洗板5次，每孔加入底物A、B，37 ℃溫育后，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，非正態(tài)分布計(jì)量資料（USP7、IL-6、TNF-α等）用“中位數(shù)（四分位間距）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間中位數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn);各指標(biāo)間的相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象臨床資料

98例研究對(duì)象的性別、年齡等臨床特征見(jiàn)表1。

2.2 乙型肝炎患者血清中USP7、IL-6、TNF-a蛋白表達(dá)變化

結(jié)果顯示，隨著治療周期的延長(zhǎng)，USP7、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平也逐漸降低，且治療1w、2w、3w、4w與治療前相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示，USP7可能參與了HBV導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.3 USP7與IL-6、TNF-a、ALT、AST的相關(guān)性分析

結(jié)果顯示，乙型肝炎患者血清USP7蛋白表達(dá)量與ALT、AST及IL-6、TNF-a的蛋白表達(dá)量均呈正相關(guān)（P<0.05）。提示，USP7可能參與調(diào)控HBV導(dǎo)致的肝臟炎性損傷。見(jiàn)表2。

3 討論

中國(guó)甲乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静≈校倚透窝椎陌l(fā)病率和死亡率均位列前三，不容小覷。乙型肝炎病毒（HBV）是一種肝嗜酸病毒，可通過(guò)免疫反應(yīng)性在人類體內(nèi)建立持久性和慢性感染[8]。目前，HBV感染導(dǎo)致乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究指出HBV是通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種炎癥因子，從而導(dǎo)致肝臟炎癥性表現(xiàn)[9，10]。因此，對(duì)乙型肝炎病程及其肝損傷的程度進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，闡明其機(jī)制并找到靈敏的監(jiān)測(cè)指標(biāo)對(duì)乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

USP7作為泛素特異性蛋白酶家族中的一員，有研究指出，它不僅作用于癌蛋白與抑癌蛋白，還可與病毒相關(guān)蛋白相互作用[11]。而乙型肝炎又是HBV病毒感染導(dǎo)致的傳染性疾病，推測(cè)，USP7在乙型肝炎中起調(diào)控作用，因此，本研究對(duì)USP7進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，USP7的表達(dá)是隨著乙型肝炎治療而逐漸降低的，且USP7與ALT、AST的表達(dá)呈正相關(guān)，提示，USP7與HBV感染導(dǎo)致的肝損傷有關(guān)，并可能參與了乙型肝炎的進(jìn)展。

TNF-α作為重要的炎癥介質(zhì)，在HBV病毒感染時(shí)可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，使肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[12]。IL-6作為多功能細(xì)胞因子，可直接參與肝臟炎癥反應(yīng)和損傷過(guò)程[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可通過(guò)多種信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期和基因表達(dá)[14]。HBV感染后炎性損傷最易出現(xiàn)，且最常見(jiàn)的異常表現(xiàn)是血清轉(zhuǎn)氨酶升高。臨床上，反應(yīng)乙型肝炎肝臟損傷的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)為ALT、AST，且與用藥直接相關(guān)。因此，本研究對(duì)TNF-α、IL-6等促炎因子以及肝損傷指標(biāo)ALT、AST進(jìn)行監(jiān)測(cè)，用以觀察肝臟炎性損傷情況，本研究結(jié)果顯示，隨著治療周期的延長(zhǎng)TNF-α、IL-6的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，并且與剛?cè)朐何粗委熐跋啾龋琓NF-α、IL-6表達(dá)水平明顯降低，并與肝功指標(biāo)ALT、AST變化趨勢(shì)一致，提示肝臟炎癥損傷減輕;通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP7蛋白表達(dá)與IL-6、TNF-α表達(dá)均成正相關(guān)，提示，USP7可能參與調(diào)控乙型肝炎炎癥反應(yīng)，有研究表明，USP7與炎癥信號(hào)通路NF-κB相互作用[15，16]。同時(shí)，有研究也顯示USP7與病毒蛋白也能發(fā)生相互作用[11]，因此，推測(cè)，在本研究中USP7可能是通過(guò)去泛素化NF-κB在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)中起作用的，也可能是通過(guò)與病毒蛋白相互作用在乙型肝炎炎癥損傷中發(fā)揮功能的。這還需要進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究。

綜上，USP7可能參與了乙型肝炎的發(fā)展進(jìn)程，其具體機(jī)制尚不明確，本課題組將繼續(xù)通過(guò)體內(nèi)、體外等實(shí)驗(yàn)探究去泛素化酶USP7調(diào)控炎癥的作用機(jī)制，以期為臨床上早發(fā)現(xiàn)、診斷和治療HBV感染引起的肝臟炎性損傷提供新思路。

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[2020-01-07收稿]