基因組拷貝數變異測序用于高危妊娠胎兒產前診斷的臨床價值評估

程龍鳳，袁靜*，魏兆蓮，李琴，周培，張小鵬，陳薇，方慧琴，吳仁花

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科，合肥 230022；2.國家衛生健康委配子及生殖道異常研究重點實驗室，合肥 230022；3. 出生人口健康教育部重點實驗室，合肥 230022；4.生殖健康與遺傳安徽省重點實驗室，合肥 230022；5. 安徽省生命資源保存與人工器官工程技術研究中心(安徽醫科大學)，合肥 230022)

產前診斷是對高危妊娠胎兒進行先天缺陷和遺傳性疾病的診斷，是預防出生缺陷、提高人口素質的主要手段。傳統的細胞遺傳學方法，如G顯帶染色體核型分析是染色體病產前診斷的一線方法[1-2]。細胞核型分辨率約為5～10 Mb，但染色體微缺失/重復綜合征難以在核型分析中被檢測出來[3]。這些染色體微缺失/重復已被確定為許多人類疾病常見病因[4]。而基于下一代測序的基因組拷貝數變異測序(CNV-seq)可檢測出全染色體組非整倍體和100 kb以上的拷貝數變異(CNV)。本研究通過染色體核型分析聯合CNV-seq對455 例不同指征的高危妊娠胎兒行產前診斷，同時分析不同指征與染色體異常的關系，比較兩種方法對染色體異常的檢出率，探討CNV-seq在臨床產前診斷中的應用價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2018 年1～12 月在安徽醫科大學第一附屬醫院產前診斷中心就診并接受侵入性產前診斷的高危妊娠孕婦臨床資料，根據不同孕周選擇羊膜腔穿刺術或臍靜脈穿刺術，羊水或臍血樣本同時送檢染色體核型分析和CNV-seq檢測。最終入組455 例，孕婦年齡18～49 歲，孕周為18～33 周。所有孕婦在侵入性產前診斷前均接受產前診斷咨詢并充分告知其穿刺相關風險、染色體核型分析和CNV-seq各自的檢測范圍和局限性后，簽署穿刺術及檢測知情同意書。

二、不同指征的定義及分類

根據不同的產前診斷指征，將高危妊娠胎兒分為以下兩類：(1)非超聲相關高危組：包括高齡(孕婦年齡≥35 周歲，包括分娩時滿35 周歲)、血清學篩查高風險、NIPT高風險、不良妊娠史以及其他；(2)超聲相關高危組：包括超聲軟指標異常和明確的胎兒超聲結構異常。

三、方法

羊水/臍血管穿刺術：孕18～23 周孕婦行羊水穿刺術，孕26～33 周孕婦行臍帶穿刺術。具體方法如下：超聲引導下進行羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺術，取羊水約25 ml，其中20 ml行染色體核型分析(320 條帶)，5 ml用于CNV-seq檢測。臍血3.5 ml，其中1.5 ml送檢染色體核型分析，2 ml用于CNV-seq。

G顯帶染色體核型分析：20 ml羊水樣本離心7 min，吸上清，留取1 ml脫落上皮細胞，加入培養基(廣州輝達)3.5 ml至培養瓶。培養12 d，觀察其細胞克隆情況，換液，第2或3天觀察是否收獲。胰酶消化2.5 min，1 500 rpm離心7 min，棄上清，低滲，固定后滴片。80℃烤箱烘烤2.5 h，采用G顯帶處理。1.5 ml臍血接種于淋巴細胞培養基(廣州輝達)中，培養72 h，加入秋水仙素，2.5 h后收獲，1 500 rpm離心7 min后處理同前。顯微鏡下計數，分析10個核型，嵌合體加倍計數。

CNV-seq檢測：提取羊水中脫落細胞或臍血細胞基因組DNA，將50 ng全基因組DNA使用限制性內切酶水解，獲得平均大小為200 bp的DNA片段，采用PCR-free建庫方法進行文庫制備(杭州貝瑞基因)。在NextSeq CN500 高通量測序平臺(杭州貝瑞基因)，36 bp單端測序，測序深度0.1×。所有測定序列，通過檢索DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed等數據庫進行CNV臨床意義的確定。

四、統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行數據處理。計量資料以均數和標準差表示，計數資料以頻數和構成比表示。

結 果

一、G顯帶染色體核型分析與CNV-seq檢測結果

1.G顯帶染色體核型分析：在455 例產前診斷的孕婦中，共檢出染色體異常22例，陽性率為4.83%(22/455)。其中，非整倍體17例(其中21-三體9例，18-三體5例，性染色體非整倍體3例)，微缺失2例，微重復2例，嵌合體1例。染色體多態5例(均為9號染色體臂間倒位)。

2.CNV-seq：CNV-seq共檢出異常42例，陽性率為9.23%(42/455)。其中致病性異常31 例，可能致病性異常11例。致病性異常中非整倍體17例、微重復4例、微缺失5例、微缺失合并微重復3例、嵌合體2例；可能致病性異常中微重復4例、微缺失6例、嵌合體1例(表1，表2)。

二、非超聲相關高危組染色體核型分析及其對應CNV-seq結果異常的情況

在非超聲異常高危妊娠胎兒中染色體核型分析檢出異常10例。CNV-seq檢測出致病性異常14例，可能致病性異常8例。

其中，NIPT高危孕婦染色體核型檢出異常8例，CNV-seq檢出致病性異常9例，可能致病性異常1例。不良妊娠史孕婦染色體核型未檢出明顯異常，CNV-seq檢出致病性異常2例，可能致病性異常2例。高齡孕婦染色體核型檢出異常2例，CNV-seq檢出致病性異常2例，可能致病性異常3例。余指標染色體核型未檢出明顯異常，CNV-seq檢出致病性異常1例，可能致病性異常2例(表1)。

三、超聲相關高危組染色體核型分析及其對應CNV-seq結果異常的情況

超聲相關的高危孕婦胎兒中染色體核型分析檢出12例異常，CNV-seq共檢出17例致病性異常，3例可能致病性異常(表2)。

表1 非超聲相關高危組染色體核型分析及其對應CNV-seq結果異常

表2 超聲相關高危組染色體核型分析及其對應CNV-seq結果異常

討 論

出生缺陷主要原因之一為染色體病和基因組病[5]，且目前尚無有效治療手段。核型分析技術對染色體數目以及結構異常的診斷可靠準確，經濟實惠，是染色體異常產前診斷的金標準被廣泛應用。但是G顯帶染色體核型分析只可檢測>5 Mb的染色體片段異常，無法辨別微小變異的缺失/重復，且對于臨床潛在風險的認知有限[6-7]。CNV-seq檢測通過在下一代測序平臺(NGS)對全基因組范圍內檢測>100 kb的染色體拷貝數變異(缺失/重復)，以及染色體非整倍體，并通過檢索數據庫進行分析其是否為異常。染色體的微缺失/微重復是胎兒致畸或智力低下等發育異常的重要原因之一[8-10]。本研究使用G顯帶染色體核型分析和CNV-seq檢測兩種方法，回顧性分析了455例有產前診斷指征的高危妊娠孕婦胎兒染色體異常情況，比較了兩種檢測方法染色體異常檢出率，并分析了不同產前診斷指征的染色體異常情況。

有研究表明，CNV-seq檢測對染色體檢查的準確性與傳統的核型分析相當且分辨率更高[11-12]。本研究中，G顯帶染色體核型分析總的異常檢出率為4.83%，CNV-seq總檢出率為9.23%，CNV-seq較傳統的細胞遺傳學檢測可多檢出4.4%異常。與之結果一致，說明CNV-seq可以提高染色體異常檢出率，進而為臨床上產前診斷及遺傳咨詢提供更多依據。

在染色體異常中，核型分析檢出非整倍體17例，CNV-seq與之檢測結果一致。核型分析檢出微缺失2例，微重復2例。經CNV-seq驗證，此4例染色體片段異常均為致病性異常，CNV-seq相對精準的定位了異常片段及其大小，對于解讀這些區域內包含的功能基因有益。倒位5例，均為9號染色體臂間倒位，其中CNV-seq檢測4例提示結果正常，另1例檢測到11號染色體片段重復，與核型分析提示的9號染色體倒位并不一致，說明CNV-seq檢測技術具有局限性，即無法檢測出染色體倒位變異，推論亦無法檢測平衡易位這類結構變異，也說明了核型分析即使對于相對較大的片段仍有漏診的可能性。此外，染色體核型分析檢出嵌合1例。有研究表明，CNV-seq技術可以檢測到低比例的嵌合體，在理想條件下可檢測低至5%的染色體非整倍體嵌合[13-14]，在臨床樣本中可發現超過10%的染色體非整倍體嵌合[15]。本研究細胞學檢測出的嵌合體核型為45，XO/46，XN經驗證為45，X[50%]/46，XY[50%]的嵌合體。另有2例染色體核型未見明顯異常，而CNV-seq檢測出嵌合情況，并給出嵌合比例。比較而言，CNV-seq對嵌合體的診斷較傳統的細胞學檢測有更高的準確性，可為臨床遺傳咨詢提供更多解讀依據。

本研究將高危妊娠孕婦分為非超聲異常高危組和超聲異常高危組。其中，非超聲異常包括高齡、血清學篩查高風險、NIPT高風險、不良妊娠史，以及其他。對于超聲異常的高危孕婦分為超聲軟指標異常以及明確的胎兒超聲結構異常。超聲軟指標并不能完全提示胎兒的結構發育異常，可能是一種正常的變異[16]。有研究表明，在超聲提示胎兒結構異常而染色體未見明顯異常的胎兒中，有6%～7%存在致病或可疑致病性異常的CNVs[17]。本研究中超聲相關的高危孕婦中，CNV-seq共檢出17例致病性異常，其中8例為染色體非整倍體，與染色體核型分析結果一致。在超聲提示軟指標或結構異常而核型分析未見明顯異常的胎兒中，CNV-seq檢測出5例致病性異常，3例可能致病性異常。其中包括1例22q11微缺失綜合征，1例22q11微重復綜合征，1例小兒巨腦畸形綜合征合并過度生長綜合征，1例2q33.1微缺失綜合征，1例角膜營養不良綜合征。我們認為，規范的產前診斷超聲檢查可發現胎兒微小的結構異常，染色體核型分析有漏診的可能性，而使用CNV-seq可提高染色體亞顯微結構上的異常檢出率。

綜上所述，本研究通過聯合應用G顯帶染色體核型分析和CNV-seq檢測技術，比較了二者對不同染色體異常檢出的優勢和局限性，分析了不同高危產前診斷指征與染色體異常的關系，認為二者聯合檢測可提高臨床產前診斷的準確性，尤其對于多指標異常的高危孕婦，可有效預防出生缺陷。但本文也有不足之處，超聲相關產前診斷指征有待于分類分析以及對胎兒出生后的進一步隨訪驗證。我國2019年4月發表專家共識認為有產前診斷條件的單位可將CNV-seq作為一線產前診斷技術應用于臨床[18]。然而致病性未知的CNV-seq檢測結果以及因部分CNV導致的疾病存在表現度與外顯率的差異，受限于目前醫學對疾病的認知，也給臨床咨詢帶來不確定性，也使得患者及家庭產生不必要焦慮的心理，同時對醫學倫理帶來挑戰。因此，應充分告知孕婦CNV-seq技術的適用范圍與局限性，使其在充分知情的前提下自主選擇。