丹參酮合成相關的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

張建紅 王喆 陳泓宇 嚴黎 呂海舟 劉琬菁 徐志超 羅紅梅

摘要?目的：丹參（Salvia miltiorrhiza）根中所含的丹參酮為二萜醌類化合物，而鑒定參與丹參酮合成的CYP450基因成為解析丹參酮生物合成途徑分子機制的關鍵步驟。方法：本實驗從丹參基因組和轉錄組數據中篩選到SmCYP81C16基因，采用RT-PCR方法克隆獲得基因cDNA全長序列，利用生物信息學分析方法分析其所編碼蛋白質的理化性質，預測該蛋白質二級結構、保守結構域等，建立系統發育進化樹;利用實時熒光定量PCR方法檢測了該基因的組織/器官表達特異性;通過遺傳轉化方法獲得了該基因的過表達轉基因毛狀根株系，通過化學檢測及代謝組學分析丹參酮類化合物在對照株系和過表達株系中的含量變化。利用實時熒光定量PCR方法檢測了毛狀根中丹參酮合成途徑關鍵酶基因中的相對表達量。結果：SmCYP81C16基因全長1 497 bp，編碼498個氨基酸殘基，該蛋白質相對分子質量為55.8 kDa;SmCYP81C16在丹參莖和根的周皮部高表達;通過化學檢測及代謝組學分析發現，與對照株系比較，在SmCYP81C16過表達陽性株系中，丹參酮類化合物的含量升高;過表達毛狀根中丹參酮合成途徑關鍵酶基因的表達量顯著上升。結論：本研究結果表明SmCYP81C16具有正向調控丹參酮生物合成的功能。本研究為利用生物技術方法提高丹參酮類化合物含量奠定基礎。

關鍵詞?丹參;細胞色素P450;丹參酮;生物合成;基因克隆;生物信息學分析;基因過表達;轉基因毛狀根

Cloning and Functional Research of SmCYP81C16 Related to Tanshinone Biosynthesis

ZHANG Jianhong1， WANG Zhe2， CHEN Hongyu1， YAN Li1， LYU Haizhou1， LIU Wanjing1， XU Zhichao1， LUO Hongmei1

（1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education， Key Lab of Chinese Medicine Resources Conservation， National Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China， China Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100193， China; 2 State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100050， China）

Abstract?Objective：Tanshinone in Salvia miltiorrhiza root is a diterpene quinone compound.Identification of the CYP450 gene involved in tanshinone synthesis has become a key step in analyzing the molecular mechanism of tanshinone biosynthesis pathway.Methods：SmCYP81C16 was screened from the genome and transcriptome data of S.miltiorrhiza and the full-length cDNA sequence was obtained and cloned by RT-PCR method.Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of physicochemical properties of the coded protein， to predict the secondary structure， conserved domains， etc.of the protein， to establish phylogenetic tree; real-time quantitative PCR method was used to detect the relative expression specificity of this gene in the tissues/organs of S.miltiorrhiza.The overexpressing transgenic hairy root was obtained by genetic transformation， and the content of tanshinones was analyzed by chemical detection and metabolomics.Real-time quantitative PCR method was used to detect the comparative expression levels of key enzymes in tanshinone biosynthetic pathway in hairy roots.Results：The full-length of SmCYP81C16 was 1 497 bp， encoding 498 amino acid residues.The relative molecular weight of this protein was 55.8 kDa.SmCYP81C16 was highly expressed in the stem and the periderm of S.miltiorrhiza.Through chemical detection and metabolomics analysis， it was found that compared with the control strain， in SmCYP81C16 overexpressing strains， the content of tanshinone compounds increased; the expression level of key enzyme genes of tanshinone synthesis pathway in overexpressing hairy roots increased significantly.Conclusion：SmCYP81C16 has the function of positively regulating tanshinone biosynthesis.This study lays a foundation for improving tanshinone biosynthesis content by using biotechnology.

Keywords?Salvia miltiorrhiza; Cytochrome P450; Tanshinones; Biosynthesis; Gene clone; Bioinformatics analysis; Gene overexpression; Transgenic hairy roots

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.009

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物，根和根莖入藥，是一種傳統的具有重要藥用價值和經濟價值的藥用植物[1]。丹參中的丹參酮類化合物在心腦血管疾病治療方面效果顯著[2]，以丹參為君藥的“復方丹參滴丸”順利完成美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）III期臨床實驗，有望成為首例獲得美國FDA認證的復方中藥。此外，有研究表明，丹參酮I具有顯著的抗癌活性[3]，丹參酮II A在抗菌抗炎[4-5]、抗腫瘤[6-7]方面也具有一定療效。

丹參酮為脂溶性二萜類化合物[8]，包括丹參酮I（Tanshinone I）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、隱丹參酮（Cryptotanshinone）、二氫丹參酮I（Dihydrotanshinone I）等十余種化合物。丹參酮類化合物通過定位在植物細胞質中的甲戊二羥酸途徑（Mevalonate Pathway，MVA）和定位在質體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2-methyl-D-erythritol 4-phosphate Pathway，MEP）合成丹參酮前體物質牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP）。GGPP經二萜合酶柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl Diphosphate Synthase，CPS）及類貝殼杉烯合酶（Kaurene Synthase-like，KSL）環化得到二萜類化合物骨架次丹參酮二烯（Miltiradiene）;次丹參酮二烯再經一系列細胞色素P450單加氧酶（Cytochrome P450，CYP450）的修飾作用最終生成丹參酮類化合物[9-12]。由此可見，CYP450與丹參酮類化合物的生物合成過程密切相關，因此，CYP450的基因克隆和功能研究對解析萜類生物合成途徑具有重要作用。

CYP450是含有亞鐵血紅素的一類酶，在細胞中主要分布在內質網和線粒體內膜上，是植物代謝最大的酶家族之一，約占植物基因組編碼基因的1%[13]。它作為一種末端加氧酶，具有廣泛的催化活性，參與多種生物化學途徑，產生初級和次級代謝物如苯丙烷類、生物堿類、萜類、脂類等[14-15]。近年來，對CYP450的結構、功能特別是對其在次生代謝途徑中的功能研究取得較大進展。在丹參中，已經鑒定到3個CYP450參與丹參酮生物合成途徑：CYP76AH1能夠催化次丹參酮二烯合成鐵銹醇（Ferruginol）[16];CYP76AH3催化鐵銹醇可以同時合成11-羥基鐵銹醇（11-hydorx Ferruginol）、柳杉酚（Sugiol）和11-羥基柳杉酚（11-hydorxy sugiol）;CYP76AK1可分別羥基化11-羥基鐵銹醇和11-羥基柳杉酚的C20位點生成11，20-二羥基鐵銹醇（11，20-hydorx Ferruginol）及11，20-二羥基柳杉酚（11，20-hydorxy Sugiol）[17]。據推測的丹參酮生物合成途徑，除了已經鑒定的3個CYP450外，仍有其他CYP450參與丹參酮生物合成過程。

本研究基于Xu等篩選的33個丹參根周皮顯著高表達的CYP450[18]，結合已發表的丹參全基因組及轉錄組信息[19-20]，篩選并克隆到可能參與丹參酮合成的SmCYP81C16;系統分析其進化關系及其表達譜，通過生物信息學預測其編碼蛋白質的理化性質及保守結構域等;構建過表達載體，利用發根農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化丹參，獲得轉基因毛狀根陽性株系，利用UPLC及代謝組學檢測分析技術檢測過表達和對照株系中丹參酮類化合物含量變化，有助于進一步驗證SmCYP81C16的具體催化功能，為進一步揭示丹參酮類化合物生物合成途徑奠定重要基礎。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：NanoDrop 2000C）;凝膠成像系統（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，型號：GelDoc XR+）;電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY-8C型）;熱循環儀（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：9700系列）;實時熒光定量PCR儀（伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，型號：CFX96）;制冰機（SANYO，日本，型號：Sim-F140）;電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：AL204-IC）;小型臺式高速離心機（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：Sigma-1-14）;金屬浴（北京銀金杏生物科技有限公司，型號：DK-8D）;搖床（太倉市實驗設備廠，型號：DDHZ-300）;-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：ULT2586-4-V48）;UPLC system BCH C18 column（Waters，美國，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;HPLC-LTQ/FTICR-MS（Thermo Fisher Scientific，美國）。

1.2?試劑?RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP441）、質粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP103-03）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP209-03）、PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit（寶日醫生物技術（北京）有限公司，貨號：6210A）、PyrobestTM DNA Polymerase（寶日醫生物技術（北京）有限公司，貨號：R005A）、T4 DNA Ligase（寶日醫生物技術（北京）有限公司，貨號：2011A）、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技術有限公司，貨號：CB501-02）、Gateway BP ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美國，貨號：11789-020）、Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美國，貨號：11791-020）;菌株E.coil DH5α Competent Cells（北京莊盟國際生物基因科技有限公司，貨號：ZK206）。

1.3?樣品?兩年生丹參（S.miltiorrhiza）99-3植物采自中國醫學科學院藥用植物研究所試驗地，于盛花期采集丹參根、莖、葉、花等部位，清水洗凈，置于液氮中速凍，并保存于-80 ℃冰箱中備用。

2?方法與結果

2.1?RNA提取和cDNA合成?取丹參不同部位的樣品，置于研缽中，液氮研磨至均勻粉末，依據天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作步驟提取丹參總RNA，利用NanoDrop2000進行含量測定以及1%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。利用無RNA酶的脫氧核糖核酸酶（DNase I）對提取的RNA進行處理，去除RNA提取物中所含的DNA;再利用寶日醫公司的PrimeScriptTM II 1st strand cDNA合成試劑盒，按照提供的反應條件和步驟將RNA反轉錄成第一鏈互補鏈DNA（cDNA）。

2.2?SmCYP81C16基因克隆及生物信息學分析?基于丹參基因組中的SmCYP81C16基因全長序列，設計基因全長擴增的特異引物SmCYP81C16-F/R，引物序列見表1。使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶擴增SmCYP81C16基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后連接pEASY-Blunt Zero載體進行測序。將克隆到的正確序列使用Softberry（http：//linux1.softberry.com/）提供的FGENESH工具進行基因序列分析，得到基因結構和編碼的蛋白質序列。使用SOMPA在線網站進行蛋白二級結構分析。通過ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）進行蛋白質理化性質預測，在InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/）在線工具中進行同源搜索，預測蛋白的保守結構域。通過Swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/）進行三維同源建模。

丹參酮合成途徑研究較為深入，SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1是丹參酮合成途徑的關鍵酶[16-17]，SmCYP71D375也參與了丹參酮合成途徑[21]。另外，在NCBI中下載搜索其他植物中已經鑒定功能的CYP450蛋白序列，通過Clustal W方法對所選蛋白序列進行序列比對，在MEGA6中使用鄰接法（Neighbour Joining Method）構建系統進化樹。

2.3?構建過表達載體?設計SmCYP81C16基因全長的過表達（Over-expression，OE）引物，根據Gateway原理在引物前添加attB序列，所用引物名稱為：SmCYP81C16-OEF/R，引物序列見表1。以重組質粒pEASY-SmCYP81C16OE為模板，使用SmCYP81C16-OEF/R引物進行PCR擴增。將PCR產物回收，再將回收產物進行BP反應，BP反應體系：25 ng attB-PCR回收產物，75 ng pDONR221入門載體，1 μL LR clonase II enzyme，補充ddH2O至5 μL。將其反應連接產物轉化DH5α感受態細胞，用含50 mg/L Kan（卡那霉素）的LB固體培養基篩選培養，回收pDONR221-OE重組質粒進行LR反應;LR反應體系：75 ng pDONR221-OE回收產物，75 ng pK7WG2D受體載體，1 μL LR clonase II enzyme，補充ddH2O至5 μL。反應連接產物轉入DH5α感受態細胞，取200 μL菌液涂布于含50 mg/L Spec（壯觀霉素）的LB固體培養基篩選培養，菌落PCR檢測后選擇陽性菌株送公司測序;取測序正確的克隆提取重組質粒pK7WG2D-SmCYP81C16，將重組質粒（pK7WG2D-SmCYP81C16）和空載體（pK7WG2D）分別轉入發根農桿菌ACCC10060中，分別獲得SmCYP81C16的過表達毛狀根株系（C16oe）和對照株系（pkoe）。

2.4?侵染丹參葉片?取生長旺盛的丹參組培苗幼嫩葉片，剪切成0.5 cm2大小的葉盤于MS培養基25 ℃預培養2 d。將轉化得到發根農桿菌ACCC10060 28 ℃培養于含50 mg/L Spec+50 mg/L Rif（利福平）的液體YEB培養基，28 ℃振蕩培養至OD600達到0.4～0.6，使用MS培養基重懸菌體，侵染丹參葉盤后將葉盤置于MS平板上，25 ℃黑暗條件下共培養48～72 h。將共培養的葉盤分別用無菌水和含500 mg/L Car（羧芐青霉素）的無菌水洗干凈后，置于含500 mg/L Car+50 mg/L Kan的MS平板上，25 ℃黑暗條件下篩選培養，選擇長勢良好的毛狀根，待其生長至2.0～3.0 cm后切下，置于含200 mg/L Car+15 mg/L Kan+0.1 mg/L IAA的6，7-V固體培養基上刺激一周后轉接至不含IAA的固體培養基，待長出較多側根后，使用熒光顯微鏡檢測載體質粒含有的標簽蛋白——綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，判斷轉基因毛狀根是否為陽性株系。將選擇的2株陽性株系標記為C16oe-4、C16oe-6轉接至6，7-V液體培養基中繼續培養。

2.5?丹參SmCYP81C16基因表達分析?取液體培養基中培養了1個月的只轉化了空載體的對照株系（pkoe）和轉化了SmCYP81C16過表達質粒的株系（C16oe），以及丹參根（R）、莖（S）、葉（L）、花（F）、周皮（R1）、韌皮部（R2）和木質部（R3），分別提取總RNA，再將這些RNA反轉錄為cDNA。挑選SmCYP81C16基因特異性片段設計實時定量PCR（qRT-PCR）引物：SmCYP81C16-qF/R，引物序列見表1。以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內參基因，制備qRT-PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq II 2.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，RNase-free ddH2O 4.5 μL。qPCR反應條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。65～95 ℃時做熔解曲線，收集Ct值，以2-△△Ct方法[22]計算不同樣品間該基因相對表達量，每個樣品設3個生物學重復。

2.6?UPLC檢測轉基因毛狀根中丹參酮類化合物含量?毛狀根在液體培養基中震蕩培養4個月后取出拍照，烘干后稱重，使用球磨儀打粉，每100 mg毛狀根用0.5 mL甲醇提取，提取物超聲處理30 min，8 000 r/min離心10 min，用0.22 μm尼龍過濾器將上清過濾至棕色液相小瓶中，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm;Waters）;檢測波長，255 nm;柱溫，25 ℃;流速，0.25 mL/min;進樣量，2 μL，流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫條件為20%～60% A（0～5 min），60%～70% A（5～20 min），70%～80% A（20～25 min），80%～100% A（25～26 min），100% A（26～30 min）。記錄各化合物的峰面積，每個樣品設3個生物學重復。

2.7?代謝組學分析轉基因毛狀根中丹參酮類化合物含量?將丹參樣本在液氮冷凍下粉碎研磨成粉末后，精密稱取上述樣品約200 mg置于10 mL具塞玻璃離心管中，加入2 mL 75%甲醇和100 μL內標溶液，封口膜封好瓶蓋，渦旋60 s，超聲提取60 min（功率140 W，頻率42 kHz），4 500 r/min離心10 min后，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后進樣分析。色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（100×2.1 mm，3.5 μm）;流動相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）;流速：0.3 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：10 μL;檢測波長：220 nm、360 nm;梯度洗脫：0～10 min，5%～15%A;10～40 min，15%～35%A;40～50 min，35%～65%A;50～55 min，65%～100%A;55～56 min，100%～5%A;56～60 min，5%A。質譜條件：離子源：ESI;檢測模式：正離子;噴霧電壓：4.2 kV;鞘氣（N2）流速：40 arb;輔助氣（N2）流速：15 arb;吹掃氣（N2）流速：3 arb;毛細傳輸管電壓：42 V;毛細傳輸管溫度：275 ℃;錐孔電壓：106 V;掃描方式：FT全掃描（Full Scan）;掃描范圍：m/z 100～2 000 Da;分辨率：50 000;MSn采用LTQ全掃描（Full Scan）方式進行掃描，通過數據依賴掃描（data dependent scan）模式對最強和次強的離子進行碰撞誘導解離（CID）;CID分辨寬度為2 Da;碰撞能量：35%;碰撞氣：高純氦氣（He）。數據采集采用Xcalibur 2.0 SR2（Thermo Fisher Scientific）軟件。

2.8?轉基因毛狀根中丹參酮生物合成途徑關鍵酶基因的表達量檢測?設計丹參酮生物合成途徑中的關鍵酶基因DXS2、CPS1、KSL1、CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1的特異性片段擴增引物，利用實時熒光定量PCR方法，檢測這些基因在轉基因毛狀根株系和對照株系中的相對表達量，以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內參基因，采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量。丹參酮生物合成途徑中的關鍵酶基因的引物見表2。

2.9?結果

2.9.1?SmCYP81C16基因克隆及其編碼的蛋白質理化性質預測分析?利用RT-PCR方法克隆得到SmCYP81C16基因全長1 497 bp，編碼498個氨基酸殘基，二級結構在線預測結果表明，SmCYP81C16蛋白的二級結構中α-螺旋占48.59%，β-折疊占4.02%，延伸鏈占11.24%，無規卷曲占36.14%。通過ExPASy對該蛋白進行理化性質進行預測分析，結果表明該蛋白相對分子質量為55.8 kDa，理論等電點為8.32。通過Interpro進行同源搜索，預測蛋白保守結構域，其結果顯示該蛋白在Inerpro數據庫中的同源序列為IPR001128。見圖1。預測該蛋白在5～27位氨基酸為跨膜螺旋結構。通過SWISS-MODEL對其進行3D同源建模，模型以5ylw.1.A為模板構建，模板蛋白質與SmCYP81C16蛋白質序列的序列同源性可達33.68%，覆蓋率為91.9%。見圖2。

2.9.2?系統發育進化分析?將SmCYP81C16蛋白質序列與其他CYP450蛋白質序列進行系統發育進化分析，所選序列為：丹參中的SmCYP76AH1（JX422213）、SmCYP76AH3（KR140168）、SmCYP76AK1（KR140169）和SmCYP71D375（AWD93836），人參（Panax ginseng C.A.Mey）中的PgCYP716A47（JN604537）和PgCYP716A53v2（JX036031），水稻（Oryza sativa L.）中的OsCYP99A3（LOC4335091）、OsCYP701A8（LOC4341343）作為參考序列，共同構建系統發育進化樹，見圖3，結果顯示SmCYP81C16與SmCYP71D375親緣關系最為相近。

2.9.3?SmCYP81C16的表達譜分析?利用SmCYP81C16的qRT-PCR的引物，以2年生丹參的根（R）、莖（S）、葉（L）、花（F）、周皮（R1）、韌皮部（R2）和木質部（R3）的cDNA為模板，檢測了該基因在丹參不同組織/器官中的表達特點。結果表明，該基因在丹參的莖（S）和根的周皮部（R1）中顯著高豐度表達，在葉中的表達量最低。見圖4。

2.9.4?SmCYP81C16過表達轉基因毛狀根獲得?將含有SmCYP81C16基因的質粒轉入發根農桿菌（ACCC10060）最終獲得轉基因毛狀根。利用qRT-PCR方法檢測了不同轉基因毛狀根株系中SmCYP81C16的相對表達量，與對照株系比較，過表達株系C16oe-4和C16oe-6中基因的過表達倍數分別為2.34倍和92.9倍，如圖5A所示，表明已成功獲得該基因的過表達毛狀根株系;SmCYP81C16過表達的轉基因毛狀根和對照株系中的毛狀根示于圖5B，可見這些毛狀根的生長發育正常，無表型差異。

2.9.5?轉基因毛狀根中丹參酮類化合物含量檢測篩選出的丹參轉基因陽性毛狀根在液體培養基中震蕩培養4個月后，拍照，見圖5B，UPLC檢測發現，與對照株系比較，二氫丹參酮Ⅰ，見圖6A、隱丹參酮，見圖6B、丹參酮Ⅰ，見圖6C和丹參酮ⅡA，見圖6D的含量在SmCYP81C16過表達的C16oe-4毛狀根株系中均呈上升趨勢，在C16oe-6株系中變化不明顯。見圖6。

2.9.6?SmCYP81C16轉基因毛狀根代謝組學分析利用高效液相色譜-傅里葉變換離子回旋共振質譜儀對丹參轉基因毛狀根進行化學成分檢測，與對照株系比較，二氫丹參酮Ⅰ，見圖7A、隱丹參酮，見圖7B、丹參酮Ⅰ，見圖7C、丹參酮ⅡA，見圖7D、丹參酮ⅡB，見圖7E、丹參酸甲酯，見圖7F和柳杉酚，見圖7H的含量在C16oe-4株系中含量顯著升高，鼠尾酮，見圖7G的含量在C16oe-4和C16oe-6株系中呈升高趨勢。其中在C16oe-4株系中，柳杉酚，見圖7H含量是對照組的3.39倍，以上數據為SmCYP81C16參與丹參體內丹參酮的生物合成提供依據。

2.9.7?SmCYP81C16轉基因毛狀根中丹參酮生物合成途徑關鍵酶基因的表達量檢測?實時熒光定量PCR檢測發現，與對照株系比較，丹參酮生物合成途徑關鍵酶基因DXS2（脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因），見圖8A、CPS1，見圖8B、KSL1，見圖8C、CYP76AH1，見圖8D的表達量在過表達毛狀根中均顯著提高。其中C16oe-4和C16oe-6株系中DXS2的基因表達量是對照的4.34和12.70倍，見圖8所示。CYP76AH3，見圖8E和CYP76AK1，見圖8F只在C16oe-6中顯著高于對照株系，但在C16oe-4株系中與對照株系比較，變化不明顯。

3?討論

隨著分子生物學以及本草基因組學[23-24]相關理論和技術的不斷發展，CYP450在次生代謝途徑中的功能正在逐步得以驗證。近年來，利用異源表達和RNA干擾等技術相繼在人參[25]、黃花蒿（Artemisia annua Linn.）[26]等多種藥用植物中鑒定出參與次生代謝途徑的CYP450。在丹參酮生物合成途徑中，目前只鑒定了3個參與丹參酮類化合物結構修飾的CYP450基因：CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1，仍有若干參與丹參酮合成的CYP450基因有待于鑒定。本研究通過對于丹參基因組[19]以及轉錄組[20]數據庫的分析，篩選并克隆丹參酮生物合成途徑的候選基因，為丹參酮生源途徑的解析提供參考。

Xu等[18]證實丹參根周皮是丹參酮合成和積累的主要部位，丹參酮生物合成途徑關鍵酶編碼基因在根及根周皮中顯著高表達。本研究檢測發現SmCYP81C16在丹參的周皮部高豐度表達，系統發育進化樹分析發現，SmCYP81C16與SmCYP71D375親緣關系最為相近，SmCYP71D375被證實在丹參體內催化丹參酮的生物合成[21]，表明SmCYP81C16可能參與丹參酮的生物合成。進一步通過轉基因毛狀根、UPLC和代謝組學等實驗技術對其功能進行鑒定，研究發現SmCYP81C16過表達的轉基因丹參毛狀根中4種主要的丹參酮類化合物的含量與對照相比呈升高趨勢，在C16oe-4株系中較明顯，在C16oe-6株系中不明顯，可能與轉基因毛狀根不同株系的穩定性不一樣有關。同時，檢測了在SmCYP81C16過表達的轉基因毛狀根中丹參酮合成途徑關鍵酶基因的表達量變化，與對照株系相比，發現關鍵酶基因表達量均呈上升趨勢，此結果為SmCYP81C16在丹參體內催化丹參酮的生物合成提供證據。

本研究推測SmCYP81C16具有正向調控丹參酮生物合成的作用，但其具體催化底物及催化產物仍未知，后期將通過體外酶促反應來進一步證實和解析SmCYP81C16催化丹參酮生物合成的機理，為丹參酮生物合成途徑的解析奠定基礎。

參考文獻

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（2020-02-10收稿?責任編輯：徐穎）