水蛭分子鑒定方法的研究進展

盧富華 李明玥 魏妙潔 石林春 劉金欣

摘要?水蛭基原復雜、市場混亂、傳統(tǒng)方法難以有效鑒別，臨床用藥的安全性無法保障。分子鑒定方法根據(jù)生物間的分子特征差異進行鑒定，不受自然環(huán)境、生長發(fā)育階段等外部因素影響，具有快速、準確、客觀的特點。目前應用于水蛭的分子鑒定方法有：基于核酸的RAPD技術(shù)、SSR技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和基于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE技術(shù)、同工酶分析技術(shù)，本文在簡述水蛭不同分子鑒定方法研究進展的基礎(chǔ)上，對水蛭不同分子鑒定方法的技術(shù)和應用特點進行比較，最后對DNA宏條形碼技術(shù)、Target-sequencing技術(shù)、電化學傳感檢測技術(shù)在水蛭混合物，特別是中成藥中水蛭成分的鑒定進行展望，旨在為水蛭鑒定方法的深入研究提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞?水蛭;混偽品;鑒定;分子鑒定;PCR;DNA條形碼鑒定;蛋白質(zhì)標記;下一代測序

Research Progress on Molecular Identification of Leech

LU Fuhua， LI Mingyue， WEI Miaojie， SHI Linchun， LIU Jinxin

（Engineering Center of Traditional Chinese Medicine Resources of Ministry of Education; Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）

Abstract?The origin of leech is complex， and its market is mixed and difficult for identification.The safety of clinical medication cannot be guaranteed.The molecular identification method is based on the difference of molecular characteristics between organisms， which is not affected by external factors such as natural environment， growth and development stage etc.And it has the characteristics of rapidity， accuracy and objectivity.At present， the molecular identification methods used in leeches are as follows：RAPD technique based on nucleic acid， SSR technique， DNA barcode technique， protein based SDS-PAGE technique， and isozyme analysis technique.Based on the research progress of different molecular identification methods of leeches， this paper compared the characteristics of their technology and application features.Finally， the method of combining DNA metabarcoding technique， target sequencing technique and electrochemical sensing detecting technique were predicted to be a potential method to identify leech components in the leech mixture or in the Chinese patent medicine， providing reference for the further study of the molecular identification methods of leeches.

Keywords?Leech; Mixed artifacts; Identification; Molecular identification; PCR; DNA barcoding identification; Protein labeling; Next-generation sequencing

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.003

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是我國傳統(tǒng)的活血化瘀藥。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定水蛭藥材為水蛭科動物螞蟥（寬體金線蛭）Whitmania pigra Whitman、水蛭（日本醫(yī)蛭）Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥（尖細金線蛭）Whitmania acranulata Whitman的干燥全體，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功能，主治血瘀經(jīng)閉，癥瘕痞塊、中風偏癱、跌打損傷[2]。水蛭中含有多種抗凝劑，已發(fā)現(xiàn)的可直接作用于凝血系統(tǒng)的成分有水蛭素、吻蛭素、類肝素、組胺等[3]。現(xiàn)代藥理研究表明水蛭在防治動脈粥樣硬化、抗凝血、抑制血栓、抗腫瘤等方面具有良好的療效[4-8]。近年來，我國以水蛭為原料藥材的中成藥有90余種[9-10]，其中通心絡(luò)膠囊、腦血康滴丸、腦心通膠囊等中成藥被納入2019年的《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》[11]。近年來，水蛭市場需求銳增、生態(tài)環(huán)境不斷惡化、群眾濫捕濫捉使得水蛭野生資源大幅減少，水蛭價格顯著上漲[12-13]，不法商販常使用混偽品、肚內(nèi)填充異物、加明礬腌漬、加鹽增重等摻假手段來謀利[14]，亟需建立準確有效的水蛭藥材真?zhèn)舞b別方法，為水蛭藥材的臨床用藥安全與療效提供有力保障。

傳統(tǒng)鑒定方法因受到遺傳可變性[15]、表形可塑性[16]、化學成分復雜性[17]的影響，常常具有一定的局限性。20世紀70年代末期以來，隨著分子生物學和信息學的快速發(fā)展，產(chǎn)生了更加直接、準確的分子鑒定方法。1980年，Botsein等[18]提出限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP），其基本原理是基因組經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過Southern印跡和特定序列探針雜交后顯示出遺傳位點的等位變異，結(jié)果穩(wěn)定可靠，但操作復雜、耗時較長，實踐中常使用與聚合酶鏈式反應技術(shù)（PCR）結(jié)合的PCR-RFLP技術(shù)進行鑒定。期間，蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)[19]被廣泛應用于分子診斷。1990年，Williams等[20]提出以PCR為基礎(chǔ)的隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）技術(shù)，但擴增結(jié)果的穩(wěn)定性較差。簡單重復序列標記（SSR）通過設(shè)計的引物進行擴增，快速穩(wěn)定，且多態(tài)性較高，呈共顯性遺傳，被廣泛用于種質(zhì)鑒定[21]。1993年，Zabeau Mare和Vos Pieter[22]發(fā)明了擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP），其基本原理是對基因組酶切片段進行選擇性擴增。1991年，香港中文大學邵鵬柱團隊[23]運用了RAPD和隨機引物PCR技術(shù)（AP-PCR）在人參與西洋參中進行DNA指紋鑒別，發(fā)表了第一篇中藥分子鑒定英文論文。1994年，Zietkiewicz等[24]提出了簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性技術(shù)（ISSR）。目前，2010年版《中華人民共和國藥典》[25]收載了蘄蛇、烏梢蛇的PCR鑒定方法，2015年版《中華人民共和國藥典》增補本已公示金錢白花蛇的快速PCR鑒定方法[2]。此外，川貝母的PCR-RFLP鑒定方法也被納入了2015年版《中華人民共和國藥典》[2]。

2003年，Hebert等[26]首次提出DNA條形碼技術(shù)，這是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來鑒定物種的一種分子生物學技術(shù)，不受經(jīng)驗限制與環(huán)境影響，已成功應用于僵蠶[27]、水牛角[28]、金錢白花蛇[29]、哈蟆油[30]等動物藥材鑒定研究。2014年，石林春等[31]構(gòu)建了包含800余種動物藥材及其混偽品和密切相關(guān)物種的“中國動物藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫”。許多優(yōu)秀的中藥分子鑒定專著也先后出版，如《中藥DNA條形碼分子鑒定》[32]《中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列》[33]等。2010年版《中華人民共和國藥典》增補本正式收載中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則[25]，標志著中藥分子鑒定成為繼四大經(jīng)典方法之后的新鑒定方法。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，更多的基因信息可被獲得，基因信息的開發(fā)、利用以及基因信息庫的構(gòu)建使得分子鑒定技術(shù)全面推廣。2018年，陳士林等出版了“十三五”規(guī)劃教材《本草基因組學》專著[34]，引領(lǐng)現(xiàn)代組學技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應用，也為中藥分子鑒定提供更多的資源。

水蛭的分子鑒定方法隨著中藥分子鑒定技術(shù)的進步而不斷發(fā)展，見圖1。本文將從DNA分子鑒定和蛋白質(zhì)標記技術(shù)兩大類簡述近年來水蛭分子鑒定方法的研究進展，分析總結(jié)不同分子鑒定技術(shù)在水蛭藥材真?zhèn)舞b定中的應用特點，旨在為今后水蛭分子鑒定方法的深入研究提供參考和借鑒。

1?DNA分子鑒定

DNA分子鑒定技術(shù)[35]是從核酸層面對中藥材進行快速、準確的鑒定，包括基于PCR的分子鑒定技術(shù)以及DNA條形碼技術(shù)，其中DNA條形碼鑒定技術(shù)應用最為廣泛。

1.1?基于PCR的分子鑒定技術(shù)

直接PCR技術(shù)[36]以微量組織樣品的裂解物為DNA模板，借助靈敏、抗干擾能力強的Taq DNA聚合酶進PCR擴增。SNP分子標記能夠為品種鑒定提供準確、快速的檢測渠道[37]。在水蛭鑒定中，常用的PCR分子鑒定技術(shù)有簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)（ISSR）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）、簡單重復序列標記（SSR）。Liu等[38]采集了全國螞蟥分布區(qū)的八個省份的樣本，用ISSR和SRAP對遺傳多樣性在物種水平上進行研究，SRAP與ISSR結(jié)果較為一致，聚類分析表明螞蟥種群間有較高水平的遺傳分化。與SRAP相比，ISSR的顯性表現(xiàn)及通用性會更好，穩(wěn)定性高，且無需預先克隆和測序，但ISSR準確性稍弱。劉飛等[39]采集了225個螞蟥樣本，利用RAPD進行遺傳多樣性分析，聚類分析結(jié)果表明在物種水平上群體間分化較大，種群內(nèi)存在一定程度變異，與Liu等結(jié)果較為一致。劉飛等[39]還對螞蟥進行了SSR開發(fā)，利用和生物素特異性結(jié)合、限制性內(nèi)切酶消化的2種策略建立SSR文庫，結(jié)果2種方法都可高效開發(fā)出SSR序列。

1.2?DNA條形碼鑒定技術(shù)

DNA條形碼鑒定技術(shù)是通過利用標準DNA片段對物種進行鑒定的方法。中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則提出動物類藥材采用細胞色素c氧化酶亞基I（COI）序列為主，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)間2（ITS2）為輔的中藥材鑒定體系[2]。據(jù)文獻報道[40-41]，在應用DNA分子標記技術(shù)對水蛭鑒定時，常用COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA等分類序列，其中COI是進化較快的序列。

Elizabeth等[42-43]針對蛭綱53個物種進行了COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA序列分析，得到系統(tǒng)進化分類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類學結(jié)果不完全一致，認為有3個物種應歸為醫(yī)蛭科，歐洲山蛭的3個新物種實際可能是南美洲山蛭的入侵物種。劉飛等[44]對寬體金線蛭及水蛭的DNA序列進行ITS測序分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)分類結(jié)果與分類學結(jié)果不完全一致，與Elizabeth等的結(jié)果相似，究其原因可能是ITS序列在進化時發(fā)生了堿基間的轉(zhuǎn)換、顛換和缺失等少量位點變異。同年，Lai Y T.等[45]對臺灣的幾個黃蛭科新種利用COI、12S rRNA、16S rRNA的部分片段對進行分析，結(jié)果可成功實現(xiàn)種類鑒定。此后，劉曉帆[46-47]采集的12個水蛭樣品（螞蟥、水蛭、柳葉螞蟥與其混偽品菲牛蛭、天目山蛭等）在條形碼長度及GC含量上均有差異，在N-J遺傳樹中水蛭正品來源與各種混偽品不聚集在一起，可將水蛭藥材與混偽品區(qū)分，菲牛蛭與水蛭十分相近，但還是各自分成獨立的一支。說明各物種相互之間可明顯區(qū)分，因此得出基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)適用于藥材水蛭的鑒定。徐云玲等[48-50]增加了與劉曉帆等不同物種的水蛭（光潤金線蛭、八目石蛭），對COI、12S和16S基因進行測序來構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)每種水蛭均形成獨立分支，成功將這6種水蛭進行鑒定分類，也得出了與此前研究相同的結(jié)果。肖凌[51]對寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、尖細金線蛭、菲牛蛭、棒紋牛蛭、光潤金線蛭、日本山蛭及八目石蛭共8個物種進行鑒定，比之前的研究又增加了新物種與新基因片段序列（ITS2、COI、12S rRNA、16S rRNA等），考察序列種間、種內(nèi)變異的Barcoding Gap，最后也得出相同結(jié)論，還提出了可將12S rRNA作為醫(yī)用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。綜上所述，應用COI及12S rRNA聯(lián)合序列在種內(nèi)保守、種間差異較大的片段設(shè)計特異引物可準確鑒別水蛭藥材與混偽品。

2?蛋白質(zhì)標記技術(shù)

蛋白質(zhì)標記技術(shù)[52]是從蛋白質(zhì)層面對中藥材進行快速、準確的鑒定，包括抗血清鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)、同工酶鑒定技術(shù)以及蛋白飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)，但將抗血清鑒定技術(shù)運用于水蛭鑒定還需進行進一步研究探索。

2.1?蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)[52]是依據(jù)中藥中所含蛋白質(zhì)分子的大小、形狀或所帶電荷差異，采用電泳分離來鑒定中藥的方法，常用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和毛細管電泳（CE）。丁月珠[53]對螞蟥清水吊干品、菲牛蛭干品、菲牛蛭鮮品采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法檢測3種水蛭樣品對纖維蛋白原的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)螞蟥清水吊干品對纖維蛋白原有水解作用，尤其是對α、β鏈的作用較強，而菲牛蛭干品與菲牛蛭鮮品對纖維蛋白原均無此作用。因此，SDS-PAGE法可將螞蟥與菲牛蛭成功鑒別。

2.2?同工酶鑒定技術(shù)

同工酶鑒定技術(shù)[52]是依據(jù)待鑒定中藥中同工酶的分子結(jié)構(gòu)、活性以及免疫原性等的特異性，使用酶活性分析、電泳檢測等技術(shù)來鑒定中藥品種的方法。羅媛媛等[54]對日本醫(yī)蛭和天目山蛭的4種同工酶（ES、MDH、POX、LDH）采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳進行比較研究，結(jié)果顯示4種同工酶在日本醫(yī)蛭和天目山蛭中的表達程度和LDH同工酶譜對比具有相似性，說明日本醫(yī)蛭和天目山蛭在遺傳上具有一定相似性，可能存在一定親緣關(guān)系。這與分類學結(jié)果相吻合，其同屬于無吻蛭目醫(yī)蛭形亞目。

2.3?蛋白飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

蛋白飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)[52]采用了飛行時間質(zhì)譜與熒光標記技術(shù)對中藥中所含肽和蛋白質(zhì)種類組成進行分析來鑒定中藥的方法，可建立出動物類中藥蛋白或肽成分的質(zhì)量指紋圖譜，在羚羊角[55]、阿膠[56]、地龍[57]等藥中已成功應用。Baskova[58]利用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對水蛭唾液腺分泌物蛋白做分析，從而辨析出幾種水蛭蛋白的組成異同，實現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上的高效、高通量分離鑒定。此方面的實驗[59-61]應用在水蛭中大多是采用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）或質(zhì)譜技術(shù)對水蛭藥材重金屬元素進行檢測研究，在使用蛋白飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)對水蛭進行鑒定還需進一步探索研究。

3?討論

3.1?水蛭市場現(xiàn)狀

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的中藥材水蛭的基原物種為水蛭科動物螞蟥、水蛭或柳葉螞蟥，然而市場常見品種主要為寬體金線蛭，日本醫(yī)蛭數(shù)量極少，甚出現(xiàn)大量非藥典規(guī)定的水蛭品種制作的水蛭藥材，如牛蛭屬的菲牛蛭、湖北牛蛭等[62]。中藥材水蛭市場比較混亂，其原因是多方面的：一是各地用藥習慣的差異。由于南北差異較大，各地用藥習慣有著顯著區(qū)別。菲牛蛭是西南水蛭的代表品種，被收錄進2005年版《廣西中藥材標準》[63]與2005年版《云南省中藥材標準》[64]，它符合部分地方用藥標準，但卻不滿足2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。二是同科屬的水蛭品種性狀上的相似性常造成誤用現(xiàn)象。常規(guī)性狀鑒定只能區(qū)分到科級別，若需定種，則須觀察環(huán)節(jié)數(shù)、生殖孔等細微特征，然而在加工成藥材的過程中，這些細微的特征常遭到破壞，大大增加了性狀鑒定的難度。并且水蛭的性狀會受到外界環(huán)境變化的影響，不同地區(qū)的水蛭在大小，性狀上也存在著細微差別，這些都對水蛭藥材的常規(guī)鑒定提出了挑戰(zhàn)。水蛭藥材及其各種混偽品的粉末在顯微鏡觀察下差異較小[42]，無法通過顯微鑒定辨別真?zhèn)巍６谒幉谋予b定中，可能是由成分含量的差異不明顯，正品和偽品與標準藥材在相同位置形成相同顏色的點[30]，無鑒別意義。三是水蛭藥材品種的歷史遺留問題。關(guān)于水蛭的藥用品種始終存在爭議。通過本草考證，我們可以發(fā)現(xiàn)各古籍文獻中對于水蛭的藥用品種描述均不夠詳細，只是簡單地強調(diào)了一下水蛭的藥用品種不包括石蛭、泥蛭、山蛭及其諸小者，并且藥用水蛭以“小者為佳”，并不涉及水蛭藥用品種的具體形態(tài)特征的描述，如《蜀本草》[65]記載：“勿誤采石蛭、泥蛭用。石、泥二蛭，頭尖，腰粗，色赤，不入藥，誤食之，則令人眼中如生煙，漸至枯損”。關(guān)于水蛭的藥用品種始終存在爭議，一些文章也對水蛭在藥典中規(guī)定的品種提出了增補修改建議[66]。四是供需缺口的擴大致使不法商販摻假混用。由于近年來水蛭市場需求不斷擴大，然而現(xiàn)有藥用品種的水蛭野生資源大幅減產(chǎn)，且相關(guān)人工養(yǎng)殖技術(shù)仍不夠成熟，無法供應水蛭藥材需求，造成藥材價格連年上漲，不法商販因此打著進口水蛭藥材品種[67]的幌子販賣非藥用品種的水蛭藥材。其中，由于海南菲牛蛭資源較多，且菲牛蛭干品具有明顯的抗凝抗血栓活性[68]，常被摻入混用。

3.2?分子鑒定技術(shù)在水蛭鑒定中的特點

基于PCR的分子鑒定技術(shù)具有多樣性[69]，最大的特點是以微量樣品為起始材料，高效擴增物種基因片段，可顯著提高工作效率。當有大量樣品需要處理時，這一優(yōu)勢則更為明顯，劉飛等[39]基于此種方法對225個螞蟥樣本進行遺傳多樣性分析就大大節(jié)省了時間和人力。DNA條形碼鑒定技術(shù)不受形態(tài)特征和生物個體發(fā)育的限制，且檢測樣本范圍廣，易于實現(xiàn)自動化和標準化，在中藥水蛭鑒定中已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的應用潛力，基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)可很好地鑒別水蛭、寬體金線蛭、尖細金線蛭、光潤金線蛭、日本山蛭、八目石蛭等物種，高效、準確。由于COI序列長度較長（658 bp），傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)對DNA嚴重降解樣品和混合樣品的鑒定較為困難，需要借助Mini-barcode技術(shù)[70]或聯(lián)合高通量測序技術(shù)進行鑒定。在蛋白質(zhì)標記技術(shù)中，已有研究表明：SDS-PAGE法可鑒別螞蟥與菲牛蛭;同工酶鑒定技術(shù)可鑒定分離日本醫(yī)蛭和天目山蛭;表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)可實現(xiàn)了對幾種水蛭蛋白的分離鑒定。因此，蛋白質(zhì)標記技術(shù)在中藥水蛭鑒定中也發(fā)揮重要作用。隨著計算機科學、生物學以及操作技術(shù)的不斷更新，中藥鑒定實現(xiàn)了標準化和數(shù)字化，中藥水蛭的鑒定方法在分子鑒定技術(shù)中也得到了進一步發(fā)展與完善，各項分子鑒定技術(shù)也有其優(yōu)點與局限性，根據(jù)不同的特點可鑒定不同的水蛭品種，可見表1。

3.3?總結(jié)與展望

在傳統(tǒng)物種分類基礎(chǔ)上，結(jié)合基因分子水平進行系統(tǒng)發(fā)育、遺傳進化、系統(tǒng)分類等方面的研究，尋找不同物種間基因分子水平的差異，使得水蛭鑒定方法更加具有科學性與多樣性，DNA條形碼鑒定技術(shù)具有廣闊的應用前景。近年來，電化學傳感檢測技術(shù)備受關(guān)注，基于DNA測序、DNA/蛋白質(zhì)相互作用以及生物分子檢測等，靈敏度高、操作簡單，目前該技術(shù)已應用在了魚類HIV病毒檢測方法構(gòu)建[71]、甘草提取液中大腸桿菌的快檢[72]，將該技術(shù)與納米技術(shù)結(jié)合成功實現(xiàn)將西紅花與它的6種摻假藥精確鑒別[73]。宏條形碼技術(shù)（DNA Metabarcoding）結(jié)合了DNA條形碼和高通量測序技術(shù)可以對混合樣本中所有物種的DNA片段進行同時檢測，Jia等[74]基于ITS2和psbA-trnH片段，以單分子實時測序技術(shù)（SMRT）對中成藥益母丸的成分進行有效檢測鑒定。Xin等[75]結(jié)合了宏條形碼技術(shù)和SMRT技術(shù)對中成藥九味羌活丸進行物種鑒定，結(jié)果可高效、靈敏地檢測九味羌活丸中各原藥材的基原。石林春等[76]利用宏條形碼技術(shù)對中成藥如意金黃散中的原料藥材進行了物種基原識別鑒定，結(jié)果除厚樸外的全部處方成分均可被檢測到，鑒定出摻雜了混偽品朝鮮蒼術(shù)和虎掌南星。Shotgun metagenomics技術(shù)可以克服宏條形碼技術(shù)對PCR擴增成功率的依賴，Xin等[77]對市售中成藥龍膽瀉肝丸采用了Shotgun metagenomic sequencing進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中含有木通的混偽品。目標測序技術(shù)（Target Sequencing）信息量大，可以完整覆蓋整個基因區(qū)域，獲得高頻SNP分型數(shù)據(jù)，對于低頻的和個體特有的變異也能夠識別，已成功應用在了271個商業(yè)辣椒品種多態(tài)性的檢測鑒定[78]。可以預見，這些新技術(shù)可應用在中成藥中水蛭成分的鑒定，對中藥水蛭鑒定技術(shù)的發(fā)展起到推動作用，使鑒定結(jié)果更加合理準確，保障中藥水蛭在臨床中的有效應用。

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（2020-02-10收稿?責任編輯：徐穎）