甲維鹽對海洋橈足類火腿偽鏢水蚤的急慢性毒性效應

衣曉燕，周 強，呂海金，趙美法，韋如意，劉光興

（1.青島職業技術學院生物與化工學院，山東 青島 266555；2.青島海洋科技館，山東 青島 266003；3.中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100； 4.中國海洋大學環境科學與工程學院，山東 青島 266100）

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（簡稱甲維鹽，Emamectin benzoate，EMB）是一種新型的高效半合成抗生素殺蟲劑，既有胃毒作用又兼觸殺作用，通過打開肌肉和神經組織的氯離子通道，增加膜對氯離子的通透性起作用，從而抑制神經沖動的傳輸，導致昆蟲癱瘓最終死亡[1-2]。在國內被廣泛應用于農業害蟲防治[3]，在國外被廣泛用于鮭魚的水產養殖業，以殺滅寄生在鮭魚體內或體表的寄生性魚虱Lepeophtheirus salmonis和Caligus rogercresseyi[4]。EMB 會隨著地表徑流或者直接排入的方式進入海洋生態系統，導致海洋水體污染，對海洋生物造成一定影響，尤其對海洋甲殼類具有較強毒性[5-6]。

海洋橈足類作為能流和物流的重要“橋梁”，在維持海洋生態平衡和穩定中起著重要作用[7-8]。浮游橈足類和寄生性橈足類具有類似的生長發育過程，EMB 可以有效殺滅各階段的寄生性橈足類魚虱，也對浮游橈足類產生了一定的毒性效應[5]，而且海洋浮游橈足類對環境變化敏感，是反映海洋生態系統受到影響的一種理想的毒性試驗材料[9]。

目前，關于EMB 對浮游動物及海洋生態系統毒性的研究國內鮮見，更多的研究聚焦在EMB 對陸生或淡水水生生物的毒性效應研究上[10-11]。筆者選取我國近海浮游橈足類常見種火腿偽鏢水蚤（Pseudodiaptomus poplesia）作為研究對象，通過急慢性毒性試驗在個體水平上研究不同濃度EMB 對其呼吸、常見氧化酶活性、生殖、生長發育等的影響，為進一步推測和評估EMB 對海洋浮游橈足類產生的毒性效應和整個海洋生態系統可能產生的危害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 火腿偽鏢水蚤的采集與培養

供試火腿偽鏢水蚤用淺水Ⅰ型浮游生物網采自青島近海，采集后即帶回實驗室暫養。在體視顯微鏡（S8APO，LEICA）下挑選健康活潑的成體，在光照培養箱（GXZ-280B-LED，寧波江南儀器廠）內用人工海水進行培養。培養條件為：溫度22±1℃，鹽度（20±1）‰，光照強度3 000 lx，光暗周期14L ∶10D，餌料單胞藻金藻（IsochrysisgalbanaParke8701）的終濃度在104～105個/mL 范圍內。

1.2 EMB 溶液的配制

稱 取 純 度 為99.4% EMB（PESTANAL?Sigma-Aldrich，USA）10 mg，溶于5 mL 二甲基亞砜（DMSO），配制成2 mg/mL 的儲備液，4℃避光保存。用0.45 μm滅菌膜過濾鹽度為（20±1）‰的人工海水，稀釋儲備液以配制濃度范圍0.02～800 ng/mL 的EMB 溶液（表1）。最高濃度梯度中試劑DMSO 的濃度為400 μL/L。每48 h 更換50%的暴露液。

1.3 急性毒性試驗

用一次性巴斯德吸管轉移火腿偽鏢水蚤成體，暴露在不同濃度EMB 溶液中96 h （表1），以獲得96h-LC50。試驗在裝有80 mL 膜濾海水的100 mL 玻璃燒杯中進行，試驗條件同培養條件。每天早上9：00 在解剖鏡下觀測并記錄個體存活情況，直至96 h。解剖針輕觸或水流緩慢沖擊，無反應者視為死亡。同樣，為獲得24h-EC50，將成體暴露在不同濃度EMB 溶液中 （表1），24 h 后觀測并記錄未死亡但活動能力明顯減弱（長時間趴在燒杯底部靜止不動，解剖針觸碰或水流緩慢沖擊才有反應）的個體數。

根據24h-EC50設置濃度梯度（表1），將成體暴露在不同濃度EMB 溶液中，24 h 后觀測火腿偽鏢水蚤的呼吸率以及過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase, GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）、超氧化物歧化酶（superoxide disnmtase, SOD）等生理指標的變化。呼吸率試驗在裝有200 mL 膜濾海水的200 mL玻璃磨口瓶中避光進行；氧化酶活性試驗在裝有800 mL 膜濾海水的1 L 玻璃燒杯中進行。

1.4 亞慢性毒性試驗

火腿偽鏢水蚤N1 期無節幼蟲孵出24 h 內，挑選健康活潑的幼體將其分別暴露在不同濃度EMB 溶液中（表1）。試驗個體在EMB 中持續暴露30 d，每只個體單獨培養在裝有7 mL 膜濾海水的10 mL 細胞培養板中，每48 h 更換50%體積的EMB 溶液并投餌，試驗條件同急性毒性試驗。當雌性個體發育至性成熟時，挑選健康活潑的雄性個體2～3 只，混合培養。每天15: 00 在解剖鏡下觀察并記錄個體的存活、所處發育階段、抱卵及孵化情況。

表1 火腿偽鏢水蚤毒性試驗設置

各濃度組90%的無節幼蟲發育至橈足幼體（C1）所需的時間即為無節幼蟲發育成橈足幼體所需的時間；90%的橈足幼體成功發育至成體（C6）的時間即為橈足幼體發育成成體所需的時間；記錄雌性個體首次抱卵的時間，計算孵化率[12]。

1.5 數據分析

利用改良的寇氏法計算求得96 h 的半數致死濃度（96h-LC50）[12]，添加趨勢線求得24h-EC50。用溶氧 儀（Yellow Springs Instruments，YSI5000）測得溶解氧含量以計算耗氧率[13]。根據南京建成生物工程研究所（http://www.njjcbio.com/）提供的試劑盒，用紫外可見分光光度計測定CAT、GST、GSH-Px 和SOD 的酶活。

用SPSS 19.0 軟件中的One-way ANOVA 進行單因素方差顯著性分析，用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 EMB 對火腿偽鏢水蚤的急性毒性

由表2 可知，不同濃度EMB 溶液暴露下，火腿偽鏢水蚤的96h-LC50為22.9 ng/mL（18.9，28.1）。由圖1 可知，不同濃度EMB 溶液暴露下，火腿偽鏢水蚤的24h-EC50為16.5 ng/mL。

表2 不同濃度EMB 溶液暴露下火腿偽鏢水蚤的死亡率 （%）

由圖2 可知，隨著EMB 濃度的增加，24 h 內火腿偽鏢水蚤成體的呼吸率總體呈現先上升后下降的趨勢。當EMB 濃度在1.25～2.5 ng/mL 范圍內時，隨著濃度的增加呼吸率顯著升高；當濃度高達20 ng/mL 時，呼吸率顯著降低。

從圖3 中可以看出，暴露24 h 后，隨著EMB 濃度的升高，火腿偽鏢水蚤的GPx、CAT 和SOD 的活性均發生顯著變化，而GST 的活性變化不明顯。其中，GPx 的活性一直處于較高水平；CAT 在較低濃度（2.5 ng/mL）時活性較高，在高濃度（10～20 ng/mL）范圍內活性受到顯著抑制；SOD 的活性變化趨勢與CAT的正好相反，在低濃度（1.25 ng/mL）下活性較低，在高濃度（20 ng/mL）下活性顯著升高。

2.2 EMB 對火腿偽鏢水蚤的亞慢性毒性

如圖4 所示，隨著EMB 濃度的升高，火腿偽鏢水蚤卵的孵化率呈現先升高后降低的趨勢。與對照組相比，在0.02～0.2 ng/mL EMB 濃度下火腿偽鏢水蚤卵的孵化率顯著提高，孵化率由3.3±0.5 個/d 增加至5±0.5 個/d；濃度繼續升高至0.2～1 ng/mL 范圍內，孵化率開始下降；當EMB 濃度達到2 ng/mL 時，火腿偽鏢水蚤卵不能正常孵化。

從圖5A 中可以看出，海水對照和溶劑對照處理下，火腿偽鏢水蚤N1 期無節幼蟲發育至橈足幼體C1所需的時間為6 d，存活率和發育率均為100%；在0.1 ng/mL EMB 處理下，時間縮短至5 d，存活率降至90%，存活的個體均成功發育為橈足幼體；在高濃度（2 ng/mL）處理下，存活率降至73%，存活個體中僅有85%的個體成功發育為橈足幼體。這表明不同濃度EMB 暴露下，無節幼蟲的生長和發育均受到影響，隨著EMB 濃度升高，無節幼體存活率和發育率呈明顯下降趨勢。

從圖5B 中可以看出，海水對照和溶劑對照處理下，橈足幼體C1 發育為成體C6 所需的時間為13 d，在 0.02～0.1 ng/mL EMB 處理下，其發育時間縮短至10～ 11 d，在1 ng/mL EMB 處理下，發育時間延長至15 d；當橈足幼體暴露在0.1 ng/mL 及以上濃度下時，隨著濃度的增加，其存活率和發育率均呈現下降的趨勢，存活率降至30%～50%，存活的個體中發育率降至30%～40%，當濃度高達2 ng/mL 時橈足幼體幾乎無法存活。

3 討 論

國外關于EMB 對海洋生物的毒性研究較為普遍。 EMB 對美洲牡蠣（Crassostreavirginica）的96h-LC50為 670 ng/mL，對雜色鳉魚（Cyprinodonvariegatus）的96h- LC50為43 000 ng/mL，對太陽魚（Lepomismacrochirus）的96h-LC50為1 800 ng/mL[14]，對糠蝦（Mysidopsisbahia）的96h-LC50為0.043 ng/mL[15]，對橈足類克氏紡錘水蚤（Acartiaclausi）、偽哲水蚤（Pseudocalanuselongatus）、長角真寬水蚤（Temoralongicornis）及擬長腹劍水蚤（Oithonasimilis）的48 h-EC50為0.12～232 ng/mL[5]。該研究中，EMB 對火腿偽鏢水蚤的96h-LC50為22.9 ng/mL （18.9，28.1），24h-EC50為16.5 ng/mL。火腿偽鏢水蚤屬于對EMB 比較敏感的種類，可作為指示生物用于海洋生態環境中EMB 污染物的監測。

持續暴露在物理（溫度、鹽度）和化學（重金屬、烴類、藻毒素等有毒物質）壓力下，水生生物體內會產生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），過量的ROS 會攻擊蛋白質、膜脂、核酸等組分，進而損傷細胞結構和功能，甚至導致細胞死亡[16-18]。 SOD、CAT、GST 及GPx 是抗氧化防御系統中重要的抗氧化酶，在保護機體免受過量自由基和過氧化物損害等方面發揮著重要作用[17,19]，可作為氧化脅迫的生物標志物[20]。該研究中，不同濃度EMB 暴露下，隨著濃度的升高CAT 的活性呈現先升高后降低的趨勢，SOD 的活性呈現先降低后升高的趨勢。有學者指出，較低濃度污染物暴露下，通過誘導產生SOD 和CAT，可增強機體消除ROS 的能力，使機體免受損害，是生物體的一種自適應反應；當污染物濃度繼續升高，超過了機體的適應能力，作為中毒反應的前兆，氧化酶活性就會降低[21-22]。Krishnakumar 等[23]的研究結果卻正好相反，唐學璽等[24]學者在研究蒽對黑鲪超氧化物歧化酶活性的影響時得知在低濃度蒽處理下SOD 活性顯著降低。GPx 以催化過氧化物為底物，反應過程中需要有還原性谷胱甘肽（GSH）的參與，有研究表明污染物對水生動物體中的GPx 活性存在誘導作用[25]，且低濃度誘導不明顯，高濃度誘導作用顯著[26]。該研究中，隨著EMB 濃度的升高，GPx 的含量一直處于較高水平。GST 作為Ⅱ相代謝解毒酶也具有過氧化酶的特性，對不同的化學污染脅迫反應不同[27-29]。該研究中，隨著EMB 濃度的升高，GST 的活性并無顯著變化。綜上所述，EMB 暴露下火腿偽鏢水蚤的抗氧化系統受到了明顯的影響。

不同濃度EMB 暴露下，火腿偽鏢水蚤的呼吸率受到明顯影響，隨著濃度的升高，24 h 呼吸率呈現先升高后降低的趨勢。有研究表明，在溫度20℃、鹽度15‰的環境下，火腿偽鏢水蚤呼吸率可達到 0.58 μL/(ind·h)[30]。該研究中設定培養環境為溫度20℃、鹽度20‰，火腿偽鏢水蚤的呼吸率達到0.68 μL/(ind·h)。低濃度EMB 刺激下，火腿偽鏢水蚤呼吸率可高達0.96 μL/(ind·h)。這應該是其通過提高自身新陳代謝來主動外排體內累積的外源污染物質。這個過程需要增強呼吸作用以提供充分的能量[31-32]。高濃度EMB刺激下，火腿偽鏢水蚤的呼吸率低至0.37 μL/(ind·h)，說明其呼吸作用直接受到抑制。

污染物長期暴露下，即使濃度較低，橈足類動物也會出現異常。耗氧量異常可使體內糖類、蛋白質和脂肪含量及電子轉移系統活力受到影響，能量收支失去平衡，進而導致行為表現異常、生長發育期異常、生長率和繁殖率的變化[33-35]。該研究結果表明， EMB 對火腿偽鏢水蚤具有慢性毒性效應，會影響處于不同生長階段的火腿偽鏢水蚤幼體的生長和發育。隨著EMB 濃度升高存活率和發育率呈下降趨勢，在0.02～0.1 ng/mL 的低濃度范圍內，EMB 會刺激橈足類的發育，發育時間明顯縮短，并且孵化速度明顯增加； 而當濃度升至1 ng/mL 時，發育時間明顯延長。Brown 等[36]在研究殺蟲劑林丹（lindane）對橈足類Bryocamp-tuszschokkei產生的毒性效應時發現，在較低濃度的污染物暴露下，幼體的數量有增加的趨勢；Andersen 等[37]和徐東暉等[12]學者在研究污染物對Acartiatonsa或P.poplesia產生的毒性效應時，發現低濃度污染物刺激可引起產卵率、孵化速度的增高。這可能是由于低濃度污染物會提高橈足類對不利環境的耐受性，在低濃度污染物的環境中進行長期暴露，橈足類可能會通過調節自我生理活動來適應不利的環境[38-39]。隨著污染物濃度的升高，橈足類受到刺激，攝食減少，代謝增加，導致其發育至成體的時間明顯延長[36]。隨著污染物濃度的繼續升高，幼體發育率顯著降低，使橈足類的數量明顯降低，從而影響該橈足類的種群數量，導致種群的衰退[35,40]，引起浮游動物群落結構的改變，從而對整個生態系統造成不利影響。

EMB 可以被橈足類動物主動攝入，也會被動擴散至生物體內，從而對機體產生不可逆的毒性作用[5]。盡管目前海洋環境中的EMB 濃度并不高，平均濃度約為 8.28×10-6ng/mL[5,41]，未影響到海洋浮游生物群落的豐度、結構和功能[6]，但隨著EMB 的大量使用，通過食物網的傳遞，必然會威脅到整個海洋生態系統乃至人類的健康。因此，對于合理使用EMB 等新型農藥以及探討其對海洋生物產生的毒性效應等研究需要更深入地挖掘。