微小核糖核酸作為急性腦梗死診斷標志物的Meta分析

張 婷 曹文齋 羅 斌 鐘 森

腦梗死在全世界范圍內，是導致患者致死、致殘的主要原因之一。在美國，每年發病人數超過790 000例，平均每4分鐘即有一人死于腦卒中[1]。腦梗死的死亡率目前在西方世界已出現下降的趨勢，可能是由于腦梗死的早期診斷，及時給予溶栓或介入治療，減少了患者致死、致殘率。腦梗死的診斷主要依賴于影像學檢查，CT對于缺血性梗死超早期的腦梗死價值有限，MRI由于檢查時間長，限制了在腦梗死早期診斷的應用。因此，發現腦梗死早期診斷的標志物，對于進一步降低患者死亡率極為重要。近年來研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)可能是一個很有潛在價值的生化標志物[2]，其可穩定表達于血液中，并呈現組織特異性。miRNA在神經系統的正常發育和病理過程中亦發揮重要的調節作用[3]。在既往關于急性腦梗死的研究中發現[4-6]，在患者血液中能檢測到異常表達的miRNA，提示miRNA可能是急性腦梗死發病時的標志物。但是這些研究普遍存在樣本量較小、受試對象不同、檢測技術的系統誤差，導致各研究結果間存在較大差異的問題，不能得出肯定的結果。本文通過Meta分析，對miRNA在急性腦梗死中的診斷效能進行系統評估，以期為臨床實踐和應用提供參考。

資料與方法

1.文獻檢索策略 應用計算機檢索Medline、PubMed、Embase、Cochrane Library Database、萬方數據庫、中國學術期刊網全文數據庫(CNKI)和維普數據庫(VIP)，檢索語種為中文和英文。主要的中英文檢索詞為腦梗死(cerebral infarction、brain infarction)、腦缺血(cerebral ischemia、brain ischemia)、微小RNA(microRNA、miRNA)、中風(stroke)。通過閱讀題目及摘要，篩選納入研究的中英文文獻。以PubMed為例，具體檢索策略見如下：Search ((((((brain infarction[MeSH Major Topic]) OR cerebral ischemia[MeSH Major Topic]) OR stroke[MeSH Major Topic])) OR ((cerebral ischemia[Title/Abstract]) OR brain ischemia[Title/Abstract]))) AND ((MicroRNA[MeSH Major Topic]) OR miRNA[Title/Abstract])。檢索時限均為建庫至2018年12月，并追溯納入文獻的參考文獻。

2.文獻的納入級排除標準 (1)納入標準：①評價miRNA在腦梗死診斷中的價值的文獻；②腦梗死的診斷以影像學(CT/MRI)為金標準；③研究提供足夠的數據滿足 2 × 2 四格表的構建；④研究類型包括隊列研究和病例對照研究；⑤研究中每組病例數≥4。

(2)排除標準：①非人體試驗；②無對照組的試驗；③綜述、會議摘要；④不能提供完整數據的文獻；⑤重復發表的文獻

3.文獻資料的篩選、提取及評價 (1)文獻的篩選及提取 由2名研究者共同制定文獻的篩選標準，分別篩選、閱讀原始文獻標題、摘要，在排除明顯不符合納入標準的文獻后對可能符合納入標準的文獻認真閱讀全文，以確定是否真正符合納入標準，最后2名研究者交叉核對文獻，如遇分歧可由第三者決定是否納入研究。提取內容包括：①納入研究的基本信息：研究文獻題目、第一作者、發表年限等；②納入研究的基線特征：研究人群及地區、研究對象的例數、檢測方法及手段等；③診斷性試驗的相關指標：靈敏度(SEN)及特異度(SPE)、或者真陽性值(true positive, TP)、假陽性值(false negative, FN)、真陰性值(true negative, TN)、假陰性值(false negative, FN)；④偏倚風險評價關鍵要素。

(2)質量評價 采用質量評價工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies,QUADAS)標準[7]進行文獻質量評定，包括14個條目：疾病譜組成、選擇標準、金標準、疾病進展偏倚、部分參照偏倚、多重參照偏倚、混合偏倚、待評價試驗的實施、金標準的實施、試驗解讀偏倚、金標準解讀偏倚、臨床解讀偏倚、難以解釋的試驗結果和退出病例。評分細則為：若認為所選擇研究符合條目，則評價為“是”。若所選研究的選擇標準沒有明確報告，那么應評價為“否”。若研究僅報告了部分選擇標準，并且現有信息不足以將該條目評價為“是”，則應評價為“不清楚”。每一條目評價結果為“是”的記為1分，總分14分。

4.統計學方法 該研究采用Stata 14和Meta-Disc 1.4對納入文獻進行統計學分析。選取靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比和ROC效應指標進行該診斷試驗的Meta分析。采用Q統計量和I2檢驗評估異質性，如果P<0.05(Q統計)或I2>50%，則采用隨機效應模型計算合并效應量，否則采用固定效應模型。對于發表偏倚，采用Deek’s檢驗來評估納入的研究。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.納入研究的基本情況 初檢共獲得相關文獻982篇，經過逐層篩選，最終納入的19篇文獻[4-6，8-23]，篩選流程圖見圖1。納入文獻包含26組miRNA，研究組和對照組共2580例，其中病例組1543例，對照組1037例。所有的患者都根據臨床癥狀結合影像學CT/MRI診斷為腦梗死，對照組為多數為健康的志愿者或體檢者。研究涉及24種miRNA的亞型。其中研究有17個在中國進行，1個在德國，1個在美國。所有研究采用qRT-PCR方法檢測miRNA表達水平。提取的相關信息參見表1。

表 1 納入 Meta 分析研究的文獻基本信息

圖1 文獻篩選的流程圖

2.納入研究的方法學質量評價 利用QUADAS對19篇研究做出評價，文獻評價得分中位數： 11分，納入所有研究文獻評分均≥10分，文獻整體質量較好。

3.異質性分析和閾值效應 采用Spearman檢驗計算真陽性率的對數值與假陽性率的對數值之間的相關系數和P值來排除閾值效應。Spearman 相關系數為-0.030，P=0.881，提示不存在閾值效應。診斷比值比的Cochran-Q值為132.17，I2值為80.3%，P<0.1，表明研究間存在異質性，可能與對照人群、試驗方法等有關。因此，在該Meta分析中應用DerSimonian-Laird法。

圖2 miRNA在急性腦梗死中的敏感度

圖3 miRNA在急性腦梗死中的特異度

圖4 miRNA在急性腦梗死中的陽性似然比

圖5 miRNA在急性腦梗死中的陰性似然比

圖6 miRNA在急性腦梗死中的診斷比值比

4.診斷價值評價 從合并的數據所做的森林圖看，異質性較為明顯(I2>70%，P<0.1)，因此，采用隨機效應模型用于評價miRNA在急性腦梗死中的診斷價值。整體miRNA診斷急性腦梗死的靈敏度為0.82(95%CI：0.80～0.83，圖2)，特異度為0.81(95%CI：0.79～0.83，圖3)，陽性似然比為5.19(95%CI：3.61～7.47，圖4)，陰性似然比是0.24(95%CI：0.20～0.30，圖5)，診斷比值比為24.01(95%CI：14.92～38.64，圖6)。SROC曲線的AUC為0.89，SROC 曲線顯示Q 值為0.82(圖7)。上述結果表明，miRNA對急性腦梗死具有較好的診斷價值。然而，由非閾值引起的異質性能夠在診斷指標的森林圖中清晰地觀察到，筆者試圖利用meta回歸(如種族人群、對照選擇和樣本來源等)來探索研究的特點。 因為在納入的研究中，miRNA均取采用qRT-PCR進行檢測，因此，檢測方法不是異質性的來源。采用種族人群、對照選擇、樣本來源和miRNA類型進行meta回歸(P>0.05)，表明未找到異質性的來源(表2)。研究采用Fagan列線圖描述miRNA對急性腦梗死的診斷效果(圖8)。結果表明，臨床檢測使用miRNA，檢測結果為陽性時，患者被診斷為急性腦梗死的概率由驗前概率20%上升至驗后概率59%，然而檢測結果陰性時，檢測者被診斷為非腦梗死患者的概率由驗前概率20%下降至驗后概率5%。由此可見，使用miRNA診斷腦梗死的精確性顯著提高。

圖7 miRNA在急性腦梗死中的SROC曲線

5.發表偏倚 發表偏倚被認為是影響診斷準確性的又一因素。采用Deek’s檢驗用于評估納入文獻是否存在發表偏倚。納入19篇研究基本均勻分布在回歸線兩側。Deek’s檢驗的P=0.18，提示無明顯的發表偏移(圖9)。

圖8 miRNA診斷急性腦梗死的Fagan列線圖

圖9 采用Deek’s法檢驗納入研究的發表偏倚

表2 Meta回歸檢測異質性的潛在來源

討 論

目前，腦血管造影是診斷腦血管疾病的金標準，但是由于其有創性及花費時間長，不利于在急性腦梗死中應用。目前2018年美國心臟學會及卒中學會(AHA/ASA)[24]仍然推薦常規CT或MRI作為急性腦梗死的影像學檢查。然而，對于超急性期和急性期腦梗死，常規頭顱CT 很難發現缺血灶。且重癥患者行CT和MRI檢查存在轉運不便，過程中風險較大的問題，有些醫療機構不能提供及時的頭顱CT或MRI檢查，這些都限制了急性腦梗死的早期診斷。Chernyshev等[25]所做的研究發現，目前的急性腦梗死的診斷方法導致21%的非腦梗死患者錯誤接受了rt-PA的溶栓治療。因此，很多研究試圖發現更好的針對急性腦梗死的診斷方法。Brunser等[26]對DWI用于急性缺血性腦卒的診斷價值進行研究，發現DWI診斷腦梗死的靈敏度為87.3%，特異度為99%。但是由于MRI花費時間長，限制了其應用。某些血清生物標志物(包括S100 蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)的變化可以反映急性腦梗死的嚴重程度、發展和轉歸。然而，這類蛋白質生物標記物由于組成復雜，且易受環境影響降解、變性，缺乏特異性[27-29]。所以，其在臨床應用亦存在局限性。

miRNA是一類小子非編碼RNA，它調節廣泛基因的表達，并在各種生物功能中發揮重要作用。miRNA與腦梗死的相關證據主要來源于動物模型中調控機制研究及臨床研究中的表達差異[23, 30]，提示miRNA可能成為急性腦梗死的新型生物學標志物和治療靶點，但是由于缺乏大量的臨床研究樣本，其診斷效果仍不明確。本研究發現在急性腦梗死患者和對照人群血液中整體miRNA的表達水平不一致，差異有統計學意義。通過篩選，共納入19篇文章，2 580例研究對象。結果顯示：采用miRNA診斷急性腦梗死的SEN為0.82，SPE為0.81，說明漏診率為18%，誤診率19%。PLR為5.19，提示急性腦梗死患者miRNA檢測陽性的概率比正常人群檢測陽性的概率高5.19倍。NLR為0.24，提示miRNA檢測結果為陰性的人群中，24%的人有可能是患有急性腦梗死的，因而不能完全排除急性腦梗死。DOR值為24.01，提示miRNA具有較高的鑒別急性腦梗死的能力。AUC值為0.89，表明其診斷效能較高。本研究結果顯示在診斷人群中，miRNA的SEN變化范圍不大(0.80 ～0.83)，提示該診斷穩定性較好，又因miRNA檢查方便快捷，所以miRNA是診斷急性腦梗死較好的手段。

本研究不足之處在于:首先miRNA檢驗急性腦梗死的研究近年來才剛剛起步，相關報道較少，雖然盡可能采取多種途徑廣泛收集國內外文獻，但由于本文只檢索了中、英文文獻，所以部分國家及地區的文獻不能納入，可能造成了一些文獻的缺失。此外，本研究的對照人群，多數為健康對照，可能與現實世界中的急性腦梗死的相似人群有差異，因此在應用本研究的結論時需要特別注意。另外，不同的研究中，樣本處理及儲存的時間、方式的不同，診斷試驗所用試劑和儀器的不同，實驗者的不同及腦梗死患者梗死部位及嚴重程度的不同，都使各研究存在一定的異質性，影響了Meta分析結果的準確性。在今后的診斷性試驗研究中，應明確應明確研究對象的選擇標準，還應保證試驗過程中的盲法。

綜上所述，miRNA檢測對急性腦梗死有較好的預測作用。但受納入研究數量和質量的限制，上述結論尚待更多高質量研究予以驗證。