灘涂土壤和種植土壤中細菌多樣性的比較

周恒　孫洪娟　繆莉

摘要：以沿海灘涂土壤和種植土壤中的細菌為研究對象，采用傳統分離培養和現代分子生物學技術對灘涂土壤和種植土壤中細菌的種類和豐度進行初步研究和比較。隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬，隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬，Lacibacterium，硝化螺旋菌屬，Povalibacter以及豐祐菌屬在種植土樣本中較為豐富，但在灘涂土樣本中卻比較匱乏;硫深海菌屬，脫硫單胞菌屬，Loktanella，濘桿菌屬，硫代鹽單胞菌屬在灘涂土樣本中較為豐富，但在種植土樣本中卻很少見。研究表明，灘涂土壤與種植土壤的微生物群落結構差異顯著。研究結果為灘涂土壤改良中微生物群落結構變化的監測提供了一定的理論與實踐基礎。

關鍵詞：灘涂土壤;種植土壤;細菌;微生物群落多樣性;PCR;高通量測序

中圖分類號： S182

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0271-05

收稿日期：2018-10-17

作者簡介：周 恒（1995—），男，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事海洋微生物生物活性及天然活性物質研究。E-mail：970069241@qq.com。

通信作者：繆 莉，博士，副教授，主要從事海洋微生物資源和海洋微生物活性及天然活性物質研究。E-mail：miaoli@yzu.edu.cn。

我國海岸線漫長，有遼闊的土壤面積，其中灘涂土壤面積約為200萬hm2。沿海地區由于氣候適宜，有充足的降水，雨熱同季，因此沿海灘涂土壤毫無疑問是一塊非常寶貴的后備土地資源[1]。在人口不斷增加、耕地日趨減少、淡水資源不足的壓力下，如何高效合理地改良利用大面積的鹽漬土壤，是我國面臨的一個迫在眉睫的問題[2]。近幾年，微生物群落結構以及多樣性分析逐漸成為研究的熱點，李新等研究了不同鹽堿程度的土壤細菌多樣性以及其優勢種群[3-4]。劉菲菲的研究表明，對目標環境微生物群落結構和多樣性進行研究和分析，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要的微生物功能類群提供可靠的依據[5]。微生物群落結構和多樣性的分析能夠較為準確地掌握各個菌群之間的關系，從而指導微生物群落功能的定向調控[5]。本試驗通過研究灘涂土壤和種植土壤中細菌群落的差異，討論灘涂土壤和種植土壤中的優勢菌群，探討如何把農用率低的沿海灘涂土壤人工改良為適合種植的土壤，尋找改良灘涂土壤一些關鍵菌群，以期為提高灘涂土壤的農業利用率，促進農業經濟發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的種植土壤采自揚州大學綠色種植試驗田，選取農田土層表面以下5～10 cm土層新鮮度較高的濕潤土壤，不含土壤生物，不含植物根際等雜質，較純，以避免提取土壤細菌微生物的DNA時混有大量土壤生物的DNA，影響試驗結果。土壤pH值為7～8，中性偏堿。研究所用的灘涂土壤為上海市沿海未開墾的位于涂層表面10 cm以下的新鮮土壤，選取不同濕潤梯度的灘涂土壤，為了便于進行土壤細菌DNA的提取，采用較為干實的灘涂土壤，pH值為7.0～8.5，中性偏堿。

LB培養基：酵母粉5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，pH值為7.0～7.2，水1 000 mL。PDA培養基：馬鈴薯200 g（切片水煮30 min，過濾取汁），葡萄糖 20 g，瓊脂15 g，pH值為7.0。高氏一號培養基：可溶性淀粉 20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，七水硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，七水硫酸亞鐵 0.01 g，pH值為7.4～7.6。土壤DNA提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤微生物分離培養及計數 試驗采用傳統分離培養技術對種植土壤和灘涂土壤中的微生物分別進行培養、計數，比較其豐度。制作固體培養基，將土壤樣品用無菌水稀釋至一定的濃度梯度并進行涂布，每個濃度梯度做5個平行對照，置于恒溫培養箱中培養。3 d后，對培養細菌的LB平板進行計數;5～7 d 后，對培養真菌的PDA平板進行計數;10～14 d 后，對培養放線菌的高氏一號平板進行計數。

1.2.2 土壤樣品DNA的提取及驗證 用土壤DNA提取試劑盒并按照試劑盒所述的步驟提取土壤樣品DNA。制作1%瓊脂糖凝膠，取5 μL待驗證樣品DNA，加入1 μL 6×loading buffer，簡單混勻后上樣，90 V，電泳1 h;電泳結束后，將凝膠放置于紫外凝膠成像儀下觀察是否有DNA條帶，并使用Nano Drop測土壤樣品DNA的濃度。

1.2.3 PCR擴增 以土壤樣品中細菌的DNA為模板和1對V3、V4正反向通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCA-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）[7]，利用DNA聚合酶對模板DNA進行PCR擴增。PCR為50 μL反應體系：各 0.2 μmol/L 正反向引物，1.5 U Pfu DNA聚合酶，4 μL 10×Pfu DNA聚合酶緩沖液，10 μmol/L dNTPs，100 ng樣品DNA，用ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃，3 min;95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個循環;72 ℃，10 min;12 ℃冷卻。PCR反應結束后，用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠在90 V，電泳1 h，進行驗證。

1.2.4 高通量測序 提取出的DNA樣品由生工生物工程（上海）股份有限公司進行高通量測序。高通量測序的主要流程包括樣品DNA進行PCR擴增后的樣本準備，然后進行文庫構建，以便于能夠在目的DNA片段兩端都連接上想要的接頭。接下來進行測序，得到DNA片段的堿基序列，最后進行數據分析，與基因庫的數據進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 分離培養的計數結果

用傳統的分離培養技術分別對種植土壤、灘涂土壤中的細菌、真菌、放線菌進行分離培養并進行計數。由表1可知，種植土壤和灘涂土壤中都是細菌數量最多，分別為1.6×106、4.3×105 CFU/g，放線菌次之，分別為7.3×105、2.4×104 CFU/g，真菌數量最少，分別為1.5×104、1.3×102 CFU/g。由于灘涂土壤中生存條件較為苛刻，灘涂土壤中細菌、放線菌、真菌數量明顯小于種植土壤，尤其是真菌的數量，與種植土壤相比，少2個數量級。

2.2 土壤樣品DNA提取及檢測

對土壤樣品分別進行DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳驗證，對提取得到的DNA質量進行觀察，結果（圖1）表明，灘涂土壤、種植土壤DNA跑膠樣品均只有1條明顯的亮帶，沒有其他的雜帶，且位置在 5 kb 之上。說明從樣品中提取的DNA較為完整，并無其他雜質;種植土壤DNA跑膠條帶明顯亮于灘涂土壤條帶，說明種植土壤樣品中DNA濃度遠高于灘涂土壤樣品，種植土壤中細菌含量明顯大于灘涂土樣品。

使用NanoDrop測定灘涂土壤樣品、種植土壤樣品中DNA濃度，結果顯示灘涂土壤樣品DNA濃度為 4.8 ng/μL，種植土壤樣品DNA濃度為 8.9 ng/μL。由所測得的數據可知，種植土壤中的細菌含量大于灘涂土壤樣品。對提取得到的DNA樣品的D260 nm/D280 nm進行測定。結果顯示，灘涂土壤樣品和種植土壤樣品的D260 nm/D280 nm分別為1.89、1.93，均在1.8～2.0之間，說明提取的灘涂土壤樣品、種植土壤樣品中的DNA都較純，質量很好。

2.3 測序結果分析

2.3.1 測序結果 對2個土壤樣品進行高通量測序，根據結果對序列進行統計，由表2可知，共得到原始序列50 111條，經過處理后得到優質序列 48 247 條。在97%的相似水平下對序列進行操作單元（OTU）的聚類，統計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產生12 930個OTU，其中相似的OUT分布數目為204，約占1.58%。

2.3.2 土壤樣品取樣深度驗證 稀釋曲線反映了樣品的取樣深度，可以用來評價測序量是否足以覆蓋所有類群。由圖2可知，2個土壤樣品的稀釋曲線未趨于平緩，說明測序數據量偏小，不足以較為完整地反映土壤樣品的細菌群落，繼續測序還可能產生較多新的OTU。

2.3.3 Alpha多樣性分析 Shannon指數可以用來表示細菌群落的多樣性程度，Shannon指數越大，說明群落多樣性越高。由圖3可以看出，2個土壤樣本的曲線都趨向平坦，說明測序數據量足夠大，可以反映土壤樣品中絕大多數的細菌物種信息;種植土壤樣本的Shannon曲線的最高點高于灘涂土壤樣本的Shannon曲線，說明種植土壤樣品中細菌多樣性大于灘涂土壤樣品，種植土壤中細菌物種較為豐富。

2.3.4 聚類分析 在屬的水平上，對土壤樣品中的細菌進行聚類，依據聚類后的各土壤樣品中不同OTU所含序列數目做出熱圖（圖4），該圖能夠反映出在菌屬水平上各樣品細菌群落結構的差異性。其中，圖中1列表示1個樣本，1行代表1個群落結構。顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅代表相對豐度越高，顏色越藍則相對豐度越低。

由圖4可知，種植土壤樣本中主要的菌屬有隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌屬（Nitrospira），Povalibacter，豐祐菌屬（Opitutus），埃希氏菌屬（Escherichia），還有一些未知分類地位的菌屬;灘涂土壤樣品中主要的菌屬有硫深海菌屬（Thioprofundum），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），Loktanella，埃希氏菌屬（Escherichia），濘桿菌屬（Lutibacter），硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas），隸屬于酸桿菌門的Gp10、Gp22，淡黃桿菌屬（Luteolibacter），脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）以及一些未知分類地位的菌屬。

在種植土壤樣品中隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter），隸屬于酸桿菌門的Gp2、Gp4、Gp6，芽單胞菌屬（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌屬（Nitrospira），Povalibacter，豐祐菌屬（Opitutus）較為豐富，但是相對的在灘涂土壤樣品中這些菌屬卻比較匱乏。在灘涂土樣品中硫深海菌屬（Thioprofundum），脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas），Loktanella，濘桿菌屬（Lutibacter），硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas）較為豐富，但是相對的，在種植土壤樣品中這些菌屬卻較為匱乏。

2.3.5 土壤細菌群落組成及豐度 從圖5中可以看出，種植土壤中的優勢菌屬為地桿菌屬（Geobacter），所占比例為5.17%，其次是隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，所占比例為5.10%，其他的優勢菌屬為隸屬于酸桿菌門的Gp6，所占比例為2.65%;芽單胞菌屬（Gemmatimonas）所占比例為2.31%;Lacibacterium所占比例為2.23%;硝化螺旋菌屬（Nitrospira）所占比例為 1.74%;Povalibacter所占比例為1.72%;隸屬于酸桿菌門的Gp2，所占比例為1.54%;隸屬于酸桿菌門的Gp4，所占比例為1.49%;豐祐菌屬（Opitutus）所占比例為1.40%。灘涂土壤中的優勢菌屬為硫深海菌屬（Thioprofundum），所占比例為8.07%，其次是脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas）所占比例為4.16%;Loktanella所占比例為 2.62%;濘桿菌屬（Lutibacter）所占比例為2.25%;硫代鹽單胞菌屬（Thiohalomonas）所占比例為2.14%;脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）所占比例為1.79%;埃希氏菌屬（Escherichia）所占比例為1.49%;隸屬于酸桿菌門的Gp10，所占比例為 1.19%;隸屬于酸桿菌門的Gp22所占比例為1.15%;淡黃桿菌屬（Luteolibacter）所占比例為1.14%。

3 結論與討論

通過研究發現，種植土壤和灘涂土壤中細菌的含量最高，放線菌次之，真菌最低;灘涂土壤中細菌、真菌、放線菌多樣性均小于種植土壤。本研究所選取的種植土壤樣本中細菌的優勢菌屬為隸屬于疣微菌門的Subdivision3 genera incertae sedis，地桿菌屬（Geobacter）等。這與已報道的寶天曼落葉闊葉林土壤中的細菌優勢群落存在較大的差異，趙愛花等揭示種植土壤中變形菌屬為絕對優勢菌屬[8]。李鵬等研究發現，小蓬竹根際土壤芽孢桿菌屬占絕對優勢[9]。譚淵等利用PCR-DGGE技術對黃連根際土壤細菌多樣性分析發現，優勢菌屬為嗜酸菌屬[10]。本研究中還檢測到芽孢桿菌屬、嗜酸菌屬，但不作為優勢菌屬。這與Roesch等采用高通量測序方法研究的結果[11-12]不一致，他們發現在一些土壤中，β-變形菌是豐度最高的亞門。不同種植土壤中的微生物種類及豐度差異明顯，這可能與檢測方法（傳統分離培養、PGR-DGGE和高通量測序技術）、土壤的種類、營養物質、光照、溫度、濕度、pH值等的不同有關，也許還與土壤中所種植植物的分泌代謝產物有一定的關系。

本研究所選取的灘涂土壤為上海市沿海未開墾的灘涂土壤。發現本灘涂土壤樣品中的優勢菌屬為硫深海菌屬（Thioprofundum）、脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas）等。隋心等在利用高通量測序對三江平原小葉章濕地土壤細菌多樣性的研究中發現，濕地的主要優勢菌群為酸桿菌、變形菌，還包括一些浮霉菌、綠彎菌和硝化螺旋菌，還有一些少量的疣微菌和芽單胞菌屬[13]。本研究所分析得到的結果與之有一些相似性也有一些差異性。硝化螺旋菌、疣微菌和芽單胞菌在本次研究所選取的灘涂土壤中也被檢測到，同樣數量也比較少。但是優勢菌屬卻有較大差異性。三江平原小葉章濕地的優勢菌群含有酸桿菌而本研究結果中卻沒有，這可能與灘涂土壤的pH值有關;造成灘涂土壤中微生物差異性的原因也可能包括灘涂土壤的含水量、含氧量[14]等。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序平臺對種植土壤、灘涂土壤細菌群落多樣性進行研究，初步獲得其在門、綱、目、科、屬等不同分類水平上的優勢類群和相對豐度。研究結果表明，細菌群落在屬水平上尚未明確分類信息的類群所占比例較大，使得物種注釋時的分辨率降低，基本上只能將細菌注釋到屬的分類水平。可能是本研究只選用了16S rDNA的 V3～V4可變區進行高通量測序，如果想要注釋到種水平，可嘗試多選用幾個可變區。高通量測序一般可以保證每個樣品測定幾萬個序列數，提高了測序深度和覆蓋度，但測序片段較短，約為 435 bp，在一定程度上降低了物種注釋的分辨率[15]。

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