基于SSR分子標記的糯玉米遺傳多樣性研究

楊亞桐　董安憶　劉松濤　Zenda Tinashe　段會軍

摘要：為明確糯玉米自交系間的親緣關系，利用19對簡單重復序列（SSR）標記對32份糯玉米自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測到80個等位基因變異，每個位點可檢測到2～7個等位基因變異，平均每個位點檢測到4.21個。通過NTSYS聚類分析方法，在遺傳相似系數為0.53處將32份糯玉米自交系劃分為6個類群，分別包含3份、2份、11份、11份、2份和3份，其中親緣關系較近的白糯6和突變體N17聚在了一起，3個雜交種（鄭黃糯2號、石彩糯和京科糯）的父母本被劃分在不同的類群中，進一步從分子水平上揭示了親本種質的遺傳差異與玉米雜種優勢的關系，為玉米育種和改良奠定了理論基礎。

關鍵詞：糯玉米;SSR;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號： S513.032

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0083-04

收稿日期：2019-01-14

作者簡介：楊亞桐（1994—），男，河北河間人，碩士研究生，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：1539245869@qq.com。

通信作者：段會軍，博士，教授，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：hjduan@hebau.edu.cn。

糯玉米（Zea mays L. var. ceratina Kulesh）是玉米屬的一個亞種[1]，是普通玉米第9染色體短臂上的Wx基因發生隱性突變形成的一種蒸煮后呈糯性的突變體[2-3]，由于糯玉米籽粒干燥后胚乳呈角質不透明、無光澤的蠟質狀，所以又被稱作蠟質玉米[4]。根據糯玉米籽粒的顏色可以分為：白糯、黃糯、紫糯、黑糯以及彩糯等，其中白糯和黃糯較為常見[5]。糯玉米具有富含支鏈淀粉[6]、營養豐富和適口性良好等優良特性，現已成為深受人們歡迎的食品和工業原料，具有較高的經濟價值。

SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）又稱為微衛星DNA[7]，是共顯性分子標記，是建立在PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應）基礎之上的一種遺傳標記，具有很高的多態性和覆蓋率，測得結果的穩定性和重復性比較好，試驗操作程序簡單，對DNA的數量和純度要求較低[8]。國內外研究學者在玉米遺傳多樣性方面做了大量的研究工作，李銳等利用SSR技術對來源于144份甜玉米群體的40個位點進行了分析，共檢測到343個等位變異，每對引物測出4-17個等位變異，平均8.58個，SSR聚類分析將144份甜玉米群體劃為7個類群[9];谷靜叢利用28對SSR引物對110份普通玉米自交系進行遺傳多樣性分析，將其劃分為六大類群，19個亞類群[10];Warburton等[11]、Reif等[12]的研究結果證實了利用SSR標記進行玉米遺傳多樣性及雜種優勢群劃分的可行性。

盡管SSR分子標記較普遍地應用于植物的遺傳多樣性研究上，但在糯玉米種質資源中的研究報道比較少。本研究利用SSR分子標記對32份糯玉米自交系進行遺傳多樣性分析，確定供試糯玉米自交系間的遺傳背景差異，為糯玉米優良品種選育和雜種優勢模式構建提供研究基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選自河北農業大學鮮食玉米課題組選育的26份糯玉米自交系，編號為N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11、N12、N13、N14、N15、N16、N17（白糯6突變體）、N18、N19（石白糯1號）、N20、N21、N22、N23、N24、N25、N26和引進的國審糯玉米品種鄭黃糯2號父母本（鄭黃糯04、鄭黃糯03）、石彩糯父母本（石糯1號、石糯2號）及京科糯父母本（白糯6、京糯6）。

1.2 方法

1.2.1 用CTAB法提取玉米葉片基因組DNA 將玉米種子浸泡1夜，播種（每個品種播3粒）;待玉米長到3～4葉時取葉提取玉米基因組DNA。具體提取步驟：（1）將無水乙醇放入-20 ℃冰箱中預冷，CTAB放入65 ℃水浴鍋中預熱1 h。（2）取新鮮玉米葉片加入適量已預熱好的CTAB中研磨，分別裝入1.5 mL離心管中，放入65 ℃水浴鍋中水浴60～75 min。（3）從水浴鍋中取出，加入等體積的氯仿異戊醇（24 ∶1）。使用搖床搖晃或用手上下翻轉 20 min。（4）放入離心機中，10 000 r/min離心 10 min。（5）取上清液至新離心管中，加入等體積氯仿異戊醇，搖晃15 min。放入離心機中，10 000 r/min離心10 min。（6）取上清液至新的離心管中，加入 -20 ℃ 預冷好的無水乙醇至1.5 mL，緩緩搖晃，出現白色絮狀沉淀（DNA），放入冰箱-20 ℃中冷卻 5 min。（7）從冰箱中取出DNA，放入離心機中離心，10 000 r/min，10 min，棄上清液。（8）加入75%乙醇（75 mL 95%乙醇+20 mL蒸餾水）70 μL，將DNA彈起，搖晃10 min，充分洗滌DNA，放入離心機中 10 000 r/min離心2～3 min。棄上清，共洗脫3次。（9）將洗脫好的DNA開蓋晾干，晾1夜即可，第2天可加去離子水溶解（100 μL）。（10）測量DNA濃度（放-20 ℃冰箱中保存）。

1.2.2 SSR引物 選用19對SSR引物（表1），由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反應 20 μL PCR反應體系如下：cDNA 2.0 μL;Buffer 2.0 μL;上下游引物各1.0 μL;Taq DNA Polymerase 0.2 μL;dNTP 1.6 μL;ddH2O 12.2 μL。體系混合均勻后加1小滴礦物油（全過程在冰上進行）。

PCR程序為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性 40 s，X ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30個循環;72 ℃延伸5 min。10 ℃保溫。注意X ℃退火，具體退火溫度參考引物Tm值;擴增完成后，放入冰箱4 ℃保存。

[5]田 蜜. 糯玉米配合力和雜種優勢的分析[D]. 長春：吉林農業大學，2017.

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