高效液相色譜法同時測定對氨磺酰苯甲酸3種有關物質

李金鳳，楊祥龍，李 廣，李秀梅，李慶娟

（瑞陽制藥有限公司，山東 淄博 256100）

對氨磺酰苯甲酸（對羧基苯磺酰胺），是制備抗風濕藥物丙磺舒的重要中間體，其制備主要是在不同條件下，對甲苯磺酰胺被氧化劑重鉻酸鉀或高錳酸鉀氧化得到[1-2]。謝建英[3]報道可在微波輻射下，以雙氧水氧化對甲苯磺酰胺獲得。作為重要中間體，對其質量控制對最終產品質量有著至關重要的作用，特別是有關物質貫穿于整個藥品研究的始終。根據其化學性質、合成路線確立了本品中可能存在雜質A、雜質B、雜質C。建立高效液相色譜同時對對氨磺酰苯甲酸中可能存在3種雜質的定量檢測方法，并對其進行了詳細的方法學研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），梅特勒電子天平（瑞士梅特勒XS205）

1.2 試藥

對氨磺酰苯甲酸原料（來源：AOCS；批號：ONS-007-29；含量：w=97.61%）；雜質A（來源：中國食品藥品檢定研究院；批號：100131-201603；w=100%）；雜質 B（來源：SINCO PHARMACHEM； 批 號 :17-07-1601； w=98.43%）；雜質 C（來源：SINCO PHARMACHEM；批號17-07-2201；w=96.76%）；雜質A,B,C的結構如圖1。

圖1 對氨磺酰苯甲酸及各個雜質的結構式

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液配制

稱取約12mg對氨磺酰苯甲酸原料，精密稱定，置25mL容量瓶中，用2.1項中流動相A溶解，定容搖勻，配制成濃度為0.48mg/mL的溶液，作為供試品溶液。

表1 兩種不同溶液梯度洗脫表

2.2.2 雜質儲備溶液配制

分別稱取雜質A、雜質B及雜質C對照品各適量，精密稱定，置于不同容量瓶中，用2.1項中流動相A溶解，定容搖勻，配制成各雜質濃度0.08mg/mL的溶液，作為對照品儲備液。

2.2.3 系統性試驗溶液

稱取約12mg對氨磺酰苯甲酸對照品，精密稱定，置于25mL容量瓶中，先加少量流動相A溶劑溶解，加0.750mL對雜質A儲備液，加0.30mL雜質B、雜質C儲備液，稀釋、定容搖勻（雜質A 為2.4μg/mL、雜質B、C為0.96μg/mL）。

2.3 系統適用性試驗

精密量取系統適用性溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2）。對氨磺酰苯甲酸、間氨磺酰苯甲酸、鄰氨磺酰苯甲酸、對甲基苯磺酰胺依次出峰，對氨磺酰苯甲酸與相鄰峰之間的最小分離度為2.099＞1.5，故該方法的專屬性比較強。

圖2 系統適用性圖譜

2.4 檢測限和定量限

精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液逐級稀釋后檢測，當信噪比S/N不小于3且重復6次進樣精密度的RSD≤15.0%時，確定次濃度為LOD，當信噪比S/N不小于10且重復6次進樣精密度的RSD≤15.0%時，確定次濃度為LOQ。雜質A、B、 C 的 LOD（μg/mL） 結 果 ： 0.13、 0.068、0.044；雜質 A、B、C的 LOQ（μg/mL） 結果：0.18、0.11、0.060。雜質 A、B、C 的 RSD%（LOD，n=6） 分別為：4.26、11.11、11.04；雜質A、B、C的RSD%（LOQ，n=6） 分別為：10.69、4.36、3.06。

2.5 線性和范圍

精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液配制成不同濃度的溶液，使濃度點在LOQ120%濃度范圍內。以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標分別繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，用R2來證實良好線性關系。

1） 雜質 A：線性范圍 0.18μg/mL～1.14μg/mL，線性方程 y=36813x-1828，R2=0.9962；

2） 雜質 B：線性范圍 0.11μg/mL～1.14μg/mL，線性方程 y=60392x-1092，R2=0.9990；

3） 雜質 C：線性范圍 0.26μg/mL～3.20μg/mL，線性方程 y=75085x+1951.4，R2=0.9982。

結果表明線性關系良好。

2.6 精密度

重復性精密量取供試品按“2.2.1”項下配制6批供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，計算6次樣品中雜質A、雜質B、雜質C、總雜相對標準偏差 ，結果分別為：1.04%、0%、3.30%、0%。結果表明該方法重復性良好。

中間精密度精密量取供試品按“2.2.1”項下配制6批供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，計算中間精密度與重復性共12次測定結果雜質A、雜質B、雜質C、 和總雜的相對標準偏差，結果分別為：2.72%、0%、7.02%、4.21%。結果表明該方法精密度良好。

2.7 準確度

準確度是在供試品中加入各雜質對照品的80%、100%、120%三個不同濃度測得的回收率所得。精密量取供試品按“2.2.1”項下配制9份不同的供試品溶液，精密加入“2.2.2”項下雜質A、B、C的對照品儲備液0.6/0.24/0.24mL、0.75/0.30/0.30mL、0.9/0.36/0.36mL共9份，定容，搖勻，配制成80%濃度 （1.92/0.768/0.768μg/mL）、100%濃度 （2.4/0.96/0.96μg/mL）、120%濃度（2.88/1.152/1.152μg/mL） 3個濃度的供試品溶液，另精密量取供試品按“2.2.1”項下配制供試品溶液一份作為本底校正溶液。分別進樣，按面積歸一法計算雜質A、B、C含量，扣除本底量后計算回收率。雜質A：平均值為96.50%，RSD=0.17%（n=9）；雜質B：平均值為98.68%，RSD=0.12%（n=9）；雜質C：平均值為99.38%，RSD=0.09%（n=9）；結果表明準確度良好。

2.8 樣品測定

精密量取不同批次（批號：20171106/20171120/20180105）供試品按“2.2.1”項下配制溶液，量取各有關物質對照品按 “2.2.2”項與

“2.2.3”項下配制系統適用性試驗溶液，按“2.1”方法進行檢測，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如出現與對照品溶液中相應已知雜質保留時間一致的色譜峰，按面積歸一法計算，其中三批樣中均未檢出雜質B、C；雜質A的檢測結果分別為：0.31%、0.31%、0.31%；總雜分別為：0.31%、0.31%、0.30%。此方法適用于對氨磺酰苯甲酸的檢測。

3 結語

本試驗建立了同時檢測對氨磺酰苯甲酸中3種有關物質的高效液相色譜法，并對方法的有效性和檢出能力進行了評價[4]。結果表明，該方法簡便、準確，可有效分離3個雜質并應用于批量檢測，為以對氨磺酰苯甲酸為中間體的丙磺舒等原料提供質量保障。