薄層色譜-酶抑制反應評價橄欖葉提取物的黃嘌呤氧化酶抑制活性

陳益勝，黃彩虹，徐學明*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

治療痛風的藥物多以黃嘌呤氧化酶為靶向[1]。不過，常見化學藥的使用伴隨較為嚴重的毒副作用。有鑒于此，研究發(fā)掘更加高效低毒的黃嘌呤氧化酶抑制劑意義重大。很多具有傳統(tǒng)藥用歷史的植物中含有豐富的活性物質，不僅效果好而且毒副作用低，是新型藥物的寶庫[1-4]。近年來的研究表明，橄欖葉提取物中的活性成分對黃嘌呤氧化酶的抑制作用尤其明顯。本研究以薄層色譜為平臺，聯(lián)用黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤氧化反應，以反應產物 (尿酸)的紫外吸光特征變化為指標建立了一種效率高、可靠性好的黃嘌呤氧化酶活性抑制能力定量評價方法，并應用到橄欖葉提取物的非靶向活性評價。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

本研究所使用的試劑均為分析純；黃嘌呤氧化酶：活性90μ/mg，中國國藥集團；分析型硅膠板：青島海洋化工；橄欖葉：市售；薄層色譜工作站。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

精確稱取10mg別嘌呤標準品到10mL棕色容量瓶，甲醇定容得到1mg/mL標準儲備液。用移液管吸取別嘌呤標準儲備液0.5mL轉移至10mL容量瓶，甲醇定容，得到0.05mg/mL標準工作溶液濃度。10g橄欖葉粉碎后與50mL提取液混合，30℃超聲水浴 30min，取 2mL液體5000r/min離心5min；取上清液2mL，經0.45μm過濾，用甲醇適當稀釋。稱取100mg黃嘌呤氧化酶，溶于10mL磷酸緩沖液 (pH=7.8)中，得到酶溶液，使用前適當稀釋。稱取100 mg黃嘌呤，溶于10mL磷酸緩沖液中，得到底物溶液，使用前適當稀釋。

1.2.2 色譜條件

用薄層點樣儀將別嘌呤標準工作液和橄欖葉提取液以條帶的形式吹掃到薄層板上。10cm×10cm薄層板上可以容納10個條帶，包括別嘌呤2個平行內標，核8個待測樣液條帶。色譜流動相：v（乙酸乙酯）/v（甲酸）/v（氨水）(7/3/0.5)，展開距離為70mm。

1.2.3 酶反應顯色

將展開后的薄層板浸入黃嘌呤氧化酶溶液。取出后立即陰涼處避光靜置5min；然后浸入黃嘌呤溶液；取出后陰涼避光靜置反應10min。

1.2.4 光密度掃描測定

用光密度儀對經過生物顯影的分離軌道進行掃描測定。儀器參數設置：反射—熒光模式，鎢燈，激發(fā)光波長290nm，不用濾光片。光密度掃描結果通過工作站軟件處理。

1.2.5 酶活抑制指數計算

按照公式（1） 計算2個別嘌呤平行內標斑點峰面積的平均值P標均

按照公式（2） 計算每個橄欖葉提取物樣品軌道斑點峰面積P樣

式中：i為酶活抑制斑點編號；n為酶活抑制斑點數量；Pi為第i個酶活抑制斑點峰面積。

按照公式（3） 計算2個橄欖葉提取物平行樣品平均斑點峰面積P樣均

按照公式（4） 計算橄欖葉提取物樣品的酶活抑制指數EI

2 結果與討論

2.1 檢測參數優(yōu)化

酶催化反應底物黃嘌呤和產物尿酸分別在265nm和290nm處有較強的紫外吸收。經過酶催化反應，在薄層板的背景區(qū)域，由于沒有物質對酶催化活性進行抑制，大部分的黃嘌呤被轉化為尿酸；而在有酶活性抑制物存在的斑點內，黃嘌呤-尿酸的轉化過程被抑制，抑制效應在一定濃度范圍內與抑制劑的濃度和種類高度相關且呈線性關系。考慮到樣品中大量基質物質的特征紫外光吸收在250nm左右，選用尿酸的最佳吸收波長290nm作為光密度計入射光的波長，降低樣品基質對測試結果的干擾。不過，由于薄層板的背景區(qū)域尿酸含量高，吸光度強，造成吸光光密度掃描得到的信號峰為倒峰，無法用軟件對其進行積分。為了解決這一問題，我們將光密度檢測模式改為熒光模式，激發(fā)波長設定為290nm，取消濾光片，使得光密度計的感應光纖能夠接收相近波長反射光。這一變化可以有效避免倒峰信號對后續(xù)信號積分計算的影響。

2.2 顯色條件優(yōu)化

顯色反應的發(fā)生必須由酶催化實現，因此酶的濃度對顯色結果有重要影響。因此首先使用別嘌呤作為指示物，優(yōu)化酶濃度。固定底物溶液濃度為0.1mg/mL，研究了0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1mg/mL 6個質量濃度梯度的酶溶液對顯色效果的影響。結果表明，當黃嘌呤氧化酶質量濃度在0.01～0.08mg/mL范圍內，內標物別嘌呤的信號峰面積隨著黃嘌呤氧化酶濃度的上升而增高。進一步增加黃嘌呤氧化酶的質量濃度到0.1mg/mL，對應的峰面積沒有明顯上升，這可能是因為酶的反應催化能力在0.08mg/mL水平達到了最高點，因此固定使用0.01mg/mL的黃嘌呤氧化酶溶液作為顯色用途。此后，研究了不同底物濃度對顯色結果的影響。這里選取0.01，0.05，0.1，0.2和0.5mg/mL的黃嘌呤溶液作為底物參與反應。光密度掃描結果顯示，在0.01～0.1mg/mL范圍內，內標別嘌呤的峰面積隨著底物濃度的上升而增高。進一步增加黃嘌呤質量濃度到0.1mg/mL不會引起內標峰面積的上升。而當黃嘌呤質量濃度增加到0.5mg/mL水平，內標峰面積反而下降，這可能是因為酶催化反應后多余的黃嘌呤殘留引起了吸光特征的變化。由此，用于酶反應顯色的底物溶液質量濃度選定為0.1mg/mL[5]。

2.3 酶抑制活性評價應用

隨后將方法應用到5種橄欖葉樣品的黃嘌呤氧化酶活性抑制能力的評價。為了方便定量比較，這里我們使用酶活抑制指數的概念來規(guī)范光密度掃描結果的計算。數據匯總結果如表1所示。很明顯，對同一種橄欖葉樣品來說，經過不同提取液得到的提取物的酶活抑制能力表現出顯著的差異。總的來說，隨著提取溶液極性的降低，提取物總的酶活抑制指數也下降，這可能是因為橄欖葉中具有酶抑制能力的成分通常是生物堿、多酚、黃酮等親水化合物，因此在極性溶液中提取率更高。此外，我們可以看到橄欖葉提取物的酶活抑制能力也表現出顯著的地區(qū)差異。地中海地區(qū)的橄欖葉提取物酶活抑制能力最高（6～7），廣東次之 （4～5），云南最低 （＜4）。這說明必須慎重使用來自不同產地的橄欖葉作為黃嘌呤氧化酶抑制劑原料。這也從側面證明了本方法的實際意義。

表1 橄欖葉樣品酶活抑制指數測定結果

3 結論

本研究建立了一種高效可靠的橄欖葉提取物黃嘌呤氧化酶活性抑制評價方法。在方法建立過程中，重點研究了光密度檢測參數、酶濃度、底物濃度和顯色時間對方法優(yōu)化的影響，同時提出了一種以抑制指數為定量評價計算方法的評價模式。本方法不僅可以避免提取物樣品中背景基質對評價可信度的影響，同時也能消除相似活性物質的互相干擾，因此可以很好地替代目前常用的吸光光度法，極大地簡化從天然產物中非靶向篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的過程。