廣東沿海香港牡蠣消化道異養(yǎng)菌統(tǒng)計及其耐藥性研究

李 炳, 王瑞旋, 謝燕純, 舒 琥, 牟紅莉, 郭子晗, 王江勇

廣東沿海香港牡蠣消化道異養(yǎng)菌統(tǒng)計及其耐藥性研究

李 炳1, 3, 王瑞旋1, 2, 謝燕純4, 舒 琥4, 牟紅莉3, 郭子晗5, 王江勇1, 3

(1. 水產科學國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學), 上海 201306; 2. 韓山師范學院, 廣東 潮州 521041; 3. 中國水產科學研究院南海水產研究所, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室, 農業(yè)部水產品加工重點實驗室, 廣東 廣州 510300; 4. 廣州大學, 廣東 廣州 510006; 5. 加利福尼亞浸會大學, 美國 加利福尼亞 92504)

本研究針對高溫時期(6月、9月)廣東沿海地區(qū)的香港牡蠣()體內異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)進行了深入的調查, 并由添加單種抗生素(分別是: 慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復方新諾明)的培養(yǎng)基中分離得到310個菌株。進一步采用紙片擴散法(kirby-bauer法)針對常見的抗生素對此310個菌株進行藥敏測試, 了解不同來源菌株的耐藥狀況。結果表明310個菌株分屬48個不同種屬, 主要是腸桿菌()、弧菌()、芽孢桿菌()、肺炎克雷伯菌()、希瓦氏菌()、不動桿菌()、假單胞菌()、短波單胞菌()、發(fā)光桿菌()、黃桿菌()、鹽單胞菌()等。在9月份從牡蠣體內分離的異養(yǎng)細菌比6月份分離的異養(yǎng)細菌高出1~2個數(shù)量級(除臺山外)。6月份從臺山地區(qū)牡蠣分離的異養(yǎng)細菌數(shù)(2.6×106~5.8×106cfu/g)最多, 高出其他地區(qū)1~3個數(shù)量級。藥敏測試結果顯示牡蠣體內異養(yǎng)細菌對20種抗生素普遍存在抗性, 尤其對青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素表現(xiàn)出較高的耐藥率。高溫時期(6月、9月)分離的異養(yǎng)菌大多數(shù)為多重耐藥細菌, 其比例分別為84.18 %和91.72 % 。本研究將為牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的疾病控制以及水產養(yǎng)殖中細菌的耐藥狀況提供重要參考依據(jù)。

牡蠣; 異養(yǎng)細菌; 弧菌; 多重耐藥性

香港牡蠣()隸屬雙殼綱, 牡蠣科, 主要分布于華南沿海咸淡水水域, 具有明顯的地方特色, 已成為中國南部沿海最主要的牡蠣養(yǎng)殖種類[1-2]。隨著養(yǎng)殖面積的擴大以及集約化養(yǎng)殖密度的增長, 大規(guī)模疾病暴發(fā)的風險也不斷增加, 而其中細菌性疾病是阻礙水產養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。值得注意的是, 牡蠣大量死亡的現(xiàn)象一般出現(xiàn)在夏季, 往往水溫較高的季節(jié)和地區(qū)更為嚴重[3-4]。當貝類體內細菌突增或養(yǎng)殖環(huán)境惡化致使貝類體質下降, 即可能引起細菌流行病的暴發(fā), 并導致貝類的大量死亡[5]。如水溫超過20℃時, 牡蠣幼體更易發(fā)病, 一旦發(fā)病, 死亡率高達90%[6]。其中, 異養(yǎng)細菌扮演著重要的角色。異養(yǎng)細菌是典型的基質限制性生物, 其個體微小、繁殖速度快、生命周期短, 異養(yǎng)細菌目前被認為是浮游生物群落的一個重要組成部分[7], 且異養(yǎng)細菌數(shù)量變化可間接反映養(yǎng)殖環(huán)境理化因子的狀況[8]。

抗生素具有殺滅或抑制細菌的作用, 被廣泛應用到水產養(yǎng)殖中, 常見的抗生素有磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類等[9]。抗生素通過抑制細菌細胞壁的合成和控制細菌的代謝等途徑影響細菌的生長[10], 因此, 抗生素的使用一定程度上緩解了細菌性疾病的暴發(fā)。由于在水產養(yǎng)殖中抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用, 從而對環(huán)境造成了污染[11]。研究表明, 在用藥的過程中, 動物通過生理代謝吸收了水環(huán)境中的部分抗生素, 而代謝率僅約為30%[12], 剩余的大部分抗生素及藥物殘留的代謝物重新被釋放到環(huán)境中, 對環(huán)境中生物的群落結構造成很大破壞。特別是疾病發(fā)生過程中作為優(yōu)勢群體的病原菌, 在環(huán)境中殘留藥物的誘導作用下, 快速進化并產生耐藥基因, 經(jīng)過持續(xù)的積累, 進而形成多重耐藥細菌[13-14]。耐藥菌的產生以及其耐藥基因的突變給水產病害的治療增加難度, 在細菌防治中加大抗生素的劑量, 使得耐藥問題更加突出, 威脅人類和其他動物的健康[15-16]。目前臨床使用的抗生素也被用在水產養(yǎng)殖行業(yè)上, 當來源于水產動物體內的耐藥菌對臨床所用的抗生素產生抗性之后, 其攜帶的耐藥基因一旦有機會進入人體, 將會對人類造成極大的威脅[17-18]。可見, 加大力度監(jiān)測水環(huán)境中細菌的動態(tài)及耐藥狀況具有重要的意義和參考價值。而目前關于水生細菌耐藥性的研究主要集中在高密度養(yǎng)殖的魚類, 從網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類分離的細菌對阿莫西林、紅霉素、慶大霉素耐藥率均在20%以上[19]。針對開放海域中的雙殼貝類體內外細菌的耐藥研究甚少, 而大部分的雙殼貝類具有濾食性特點, 其與環(huán)境的關系最為密切, 也最能反應水體環(huán)境狀況。因此本研究以廣東沿海地區(qū)的典型雙殼貝類——香港牡蠣為對象, 對其體內異養(yǎng)菌進行分離鑒定、分析, 研究牡蠣在高溫時期(6月份、9月份)中異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量、種類組成的變化以及對常用抗生素耐藥率的變化, 旨在為牡蠣細菌性疾病的預警及海洋微生態(tài)的環(huán)境健康研究提供數(shù)據(jù)基礎和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與異養(yǎng)菌統(tǒng)計

2018年6月、9月在廣東沿海地區(qū)采取香港牡蠣(圖1)。 6月份采樣地點: 汕頭(117°08′E, 23°46′N)、惠州(114°57′E, 22°71′N)、陽江(111°79′E, 21°68′N)、江門(112°57′E, 21°77′N)、臺山(112°78′E, 22°27′N)。9月份采樣的地點為臺山(112°78′E, 22°27′N)、汕尾(115°37′E, 22°78′N)、汕頭(117°08′E, 23°46′N)、湛江(109°75′E, 20°89′N)、陽江(111°79′E, 21°68′N)。采樣點溫度: 25.4℃~29.8℃。采樣點鹽度: 18.4~32.5。在每個采樣點隨機選取5~10只牡蠣, 用無菌生理鹽水清洗干凈后, 稱取0.5 g 的牡蠣消化道置于滅菌后的玻璃勻漿器中, 加入1 mL無菌生理鹽水混合后磨成勻漿, 以10–2、10–3的稀釋度進行稀釋, 分別涂布于3種培養(yǎng)基Brain Heart Agar(BHA)培養(yǎng)基、Thio-sulfate Citrate Bile Salts(TCBS)培養(yǎng)基、Mueller-Hinton Agar(MHA)培養(yǎng)基(均購于環(huán)凱生物科技有限公司)。各個梯度均設置3個平行組, 涂布后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h, 然后對培養(yǎng)基的異養(yǎng)細菌和弧菌進行計數(shù)。BHA培養(yǎng)基計數(shù)結果為異養(yǎng)細菌總數(shù), TCBS培養(yǎng)基計數(shù)結果為弧菌數(shù), MHA培養(yǎng)基計數(shù)結果用于計算單種藥物具有抗性的菌株比例見1.4。

圖1 廣東省采樣位點分布圖

1.2 耐藥菌株(單一藥物)的分離

通過添加單種藥物的培養(yǎng)基平板篩選培養(yǎng)耐藥菌株, 取1.1中勻漿液(10–2稀釋度)涂布于MHA培養(yǎng)基分別添加了慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復方新諾明7種藥物的MHA培養(yǎng)基, 涂布后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h, 然后進行平板計數(shù), 并隨機挑取單菌落, 經(jīng)劃線分離純化后用甘油進行保存(–80℃), 后續(xù)菌株鑒定見2.2和藥敏測試分析見2.3。

1.3 細菌基因組DNA的提取及菌株的16S rDNA的PCR擴增

DNA Maker、PCR-mix (含有 Taq DNA 聚合酶、d NTPs、緩沖液等 PCR 擴增必需組分)、dd H2O均購于廣州東盛科技有限公司; 細菌DNA提取試劑盒(Mabio)購于廣州吉瑞生物科技有限公司; 引物由天一輝遠生物科技有限公司合成。以質檢合格的細菌DNA為模板, 進行16S rDNA的PCR擴增, 擴增體系及反應條件具體如下:

反應體系(25 μL體系): PCR-mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。引物8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行擴增。擴增條件為: 95℃ 5 min, 95℃ 40 s, 55℃ 40 s, 72℃ 45 s, 第2步到第四步進行30個循環(huán), 72℃ 10 min, 4℃終止反應。

PCR擴增獲得菌株的16S rDNA, 然后進行瓊脂糖凝膠電泳, 得到單一條帶之后, 將樣品送由廣州天一輝遠基因科技有限公司進行雙向測序, 將測序結果輸入Gen Bank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行比對, 確定菌株的種類。

1.4 藥敏測試及耐藥率分析

所用藥敏紙片包括: 恩諾沙星(10 μg/片)、復方新諾明(25 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、呋喃唑酮(10 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、青霉素(10 U/片)、鏈霉素(10 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、萬古霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、克林霉素(20μg/片)(均購于杭州生物試劑有限公司)。添加到培養(yǎng)基中的藥物粉劑分別是: 慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復方新諾明(7種藥粉均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

藥敏測試方法采用紙片擴散法(Kirby-bauer 擴散法, 簡稱 K-B法), 操作主要如下: 用斜面培養(yǎng)基活化菌株后在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 加入1 mL無菌生理鹽水, 渦旋震蕩后將斜面培養(yǎng)基上的菌苔洗脫下來, 混勻后吸100 μL菌液在MHA培養(yǎng)基上, 用涂布棒均勻涂開, 待菌液干后, 用滅菌的鑷子夾取藥敏紙片分別貼在培養(yǎng)基表面, 確保其與培養(yǎng)基充分接觸, 之后將其放在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h, 用游標卡尺測量抑菌圈, 記錄抑菌圈的直徑, 根據(jù)NCCLS 的藥敏實驗標準判定(表1)細菌對抗生素的敏感程度, 即敏感(S)、中度(I)、耐藥(R)。將判定為R的菌株標記為耐藥菌株, 同時對3種及3種以上的抗生素存在抗性的判定為多重耐藥(Multiple-anti-biotics resistance, MAR)。

表1 20種抗生素的藥敏試驗判定標準

對單種藥物具有抗性的細菌與異養(yǎng)細菌的比率:

對單種藥物具有抗性的細菌比例=單種藥物平板

計數(shù)結果/未加抗生素平板計數(shù)結果×100%

耐藥菌株對多種藥物的耐藥率:

耐藥率(%)=耐藥菌株數(shù)量/受試菌株總數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 軟件整理, 各樣品之間的差異性分析采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 結果與討論

2.1 不同采樣地點牡蠣體內異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量

6月份的數(shù)據(jù)顯示, 廣東各沿海養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內異養(yǎng)細菌數(shù)由高到低依次為: 臺山(2.6×106~5.8× 106cfu/g)>江門(2.2×105~2.8×105cfu/g)>惠州(3.6× 104~7.8×104cfu/g)>汕頭(4.2×104~5.2×104cfu/g)>陽江(6.6×103~9.8×103cfu/g)。如圖2所示, 臺山地區(qū)異養(yǎng)細菌數(shù)量高出其他地區(qū)1~3個數(shù)量級。各地牡蠣體內弧菌數(shù)量由高到低依次為: 臺山(4.8×105~5.6× 105cfu/g)>江門(3.6×104~1.9×105cfu/g)>汕頭(2.2×104~ 3.2×104cfu/g)>惠州(6.8×103~1.8×104cfu/g)>陽江(8.0× 102~3.2×103cfu/g)。

圖2 6月份各采樣點的異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量

9月份廣東各沿海養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內異養(yǎng)細菌總數(shù)由高到低依次為: 湛江(1.5×106~1.8×106cfu/g)>汕頭(5.8×105cfu/g)>陽江(2.2×105~2.4×105cfu/g)>汕尾(1.2×105~1.4×105cfu/g)>臺山(8×103~1.8×104cfu/g), 各地區(qū)之間異養(yǎng)細菌數(shù)量差異不顯著, 均在1個數(shù)量級之間(圖3)。各地牡蠣體內弧菌數(shù)量由高到低依次為: 湛江(8.0×103~1.9×104cfu/g)>陽江(6.6×103~6.8× 103cfu/g)>臺山(6.6×103~6.8×103cfu/g)>汕頭(2.0×103~ 4.0×103cfu/g)>汕尾(6.9×102~7.1×102cfu/g)。

圖3 9月份各采樣點的異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量

據(jù)報道夏季養(yǎng)殖海水中營養(yǎng)豐富, 細菌將會大量增殖[20]。本研究顯示, 在6月份與9月份汕頭、臺山及陽江的牡蠣體內異養(yǎng)細菌數(shù)量均處于較高水平, 而不同地區(qū)存在不同程度的差異, 而同一地區(qū)不同月份也存較大的差異, 總體上, 6月份牡蠣體內異養(yǎng)細菌比9月份異養(yǎng)細菌低1~2個數(shù)量級, 如陽江地區(qū)6月份與9月份的異養(yǎng)細菌數(shù)量差異極顯著(<0.01), 相差1~2個數(shù)量級(圖4)。其中比較特別的, 臺山地區(qū)6月份異養(yǎng)細菌數(shù)量則比9月份異養(yǎng)細菌數(shù)量高1~2個數(shù)量級, 異養(yǎng)細菌數(shù)量差異極顯著(<0.01)。其原因可能與臺山養(yǎng)殖區(qū)降水較少導致鹽度、溫度升高有關, 已有報道異養(yǎng)細菌易受養(yǎng)殖環(huán)境(有機質、鹽度、溫度、pH及水體營養(yǎng)鹽)的影響[21]。

圖4 6月與9月異養(yǎng)細菌數(shù)量

2.2 牡蠣體內耐藥細菌的分析

本次研究由沿海采樣點的香港牡蠣體內共分離純化耐藥菌株310個。其中, 陽江地區(qū)分離耐藥菌株73個、臺山地區(qū)分離耐藥菌株64個、惠州地區(qū)分離耐藥菌株49個、汕尾地區(qū)分離耐藥菌株36個、汕頭地區(qū)分離耐藥菌株35個、湛江地區(qū)分離耐藥菌株30個、江門地區(qū)分離耐藥菌株23個。經(jīng)16S rDNA序列分析比對結果顯示, 此310個菌株分別屬于48種不同種屬, 主要為腸桿菌()、弧菌()、芽孢桿菌()、肺炎克雷伯菌()、希瓦氏菌()、不動桿菌()、假單胞菌()、短波單胞菌()、發(fā)光桿菌()、鹽單胞菌()、黃桿菌()等。眾所周知, 弧菌是一種嗜鹽性細菌, 其廣泛分布于海洋中, 屬于條件致病菌, 當外部鹽度條件發(fā)生改變或自身發(fā)生變異時, 就會大量增殖[22]。據(jù)報道弧菌的數(shù)量達到一定閾值, 水產動物將會被感染發(fā)病[23]。此外, 本次研究獲得菌株經(jīng)序列比對, 分離得到的不動桿菌屬主要為鮑曼不動桿菌()。據(jù)報道, 近年來鮑曼不動桿菌耐藥問題越來越嚴重, 鮑曼不動桿菌在環(huán)境中處于優(yōu)勢地位可能與耐藥特性有關[24]。而在復雜的水環(huán)境中, 高溫、高鹽天氣時, 弧菌、希瓦氏菌、不動桿菌等條件致病菌大量增殖, 對水產養(yǎng)殖動物來說是潛在的風險[25-26], 尤其是包括牡蠣在內的雙殼貝類, 發(fā)病前甚至發(fā)病初期都難以及時發(fā)現(xiàn)癥狀, 因此, 在高溫季節(jié)時期, 定時監(jiān)測異養(yǎng)細菌和弧菌的數(shù)量動態(tài)變化, 有助于盡早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖貝類的異常情況, 從而及時采取科學的防治措施, 有效預防和控制大規(guī)模細菌性疾病的暴發(fā)。

2.3 牡蠣體內異養(yǎng)細菌的耐藥性

通過添加單種藥物的MHA培養(yǎng)基和未加抗生素的MHA培養(yǎng)基得到對單種藥物具有抗性的菌株比例, 由高到低為: 利福平(5.1%)>呋喃唑酮(4.2%)>慶大霉素(2.1%)>氯霉素(1.1%)>恩諾沙星(0.6%)>環(huán)丙沙星(0.3%)>復方新諾明(0.2%)。

另外, 對單種藥物平板篩選得到的 310個菌株進行20種藥物的藥物敏感性實驗, 結果如圖5所示, 6月份篩選的菌株對呋喃唑酮耐藥率高達86%, 萬古霉素和克林霉素耐藥率達到78%以上, 而對其他抗生素均表現(xiàn)一定程度的耐藥性。9月份篩選的菌株對克林霉素、青霉素、呋喃唑酮耐藥率均在78%以上, 其中對克林霉素耐藥的菌株比例高達88%。除此之外, 所有受試菌株均對青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素表現(xiàn)抗性, 而對氟苯尼考、恩諾沙星以及環(huán)丙沙星則較敏感。

圖5 菌株對20種抗生素的耐藥率

本研究中牡蠣體內異養(yǎng)細菌對青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素普遍存在耐藥性, 對這六種抗生素的耐藥率均高于50%。其中6月份分離的菌株對呋喃唑酮和萬古霉素耐藥率明顯高于其他抗生素, 均在81%以上。9月份分離的菌株對克林霉素、青霉素耐藥率均在78%以上, 以往的研究表明青霉素的耐藥率也較高[27]。因為青霉素、克林霉素主要針對革蘭氏陽性菌(G+), 其作用是抑制G+細菌細胞壁上的肽聚糖合成, 而在水產養(yǎng)殖水體中主要是革蘭氏陰性菌(G–)。

多重耐藥性是指菌株同時對3種或3種以上抗生素存在抗性[15], 對牡蠣體內分離的菌株進行20種常見抗生素的敏感性試驗, 結果顯示, 6月份分離的多重耐藥菌株占84.18%。9月份分離的多重耐藥菌株占91.72%。其中6月份分離的菌株中有27.12%對10種以上抗生素表現(xiàn)出耐藥性。9月份分離的菌株中有47.36%對10種以上抗生素表現(xiàn)出耐藥性。

表2 牡蠣體內異養(yǎng)細菌的多重耐藥率/%

自20世紀50年代多重耐藥細菌的發(fā)現(xiàn), 一直備受關注。在此前研究中從軍曹魚中分離的菌株多重耐藥菌株占9.8%[27], 而本研究中分離的多重耐藥菌株高達80%以上。在水產養(yǎng)殖中分離多重耐藥細菌數(shù)量正逐年升高, 其耐藥性通過基因水平轉移方式不斷傳遞、擴散, 威脅公共衛(wèi)生健康。本研究還發(fā)現(xiàn)一個重要結果, 即經(jīng)單種抗生素篩選分離得到的菌株對多種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性, 具有較強的多重耐藥性。細菌主要通過膜的主動外排系統(tǒng)使細胞內泵中的抗生素排出和細胞膜的滲透性阻礙抗生素進入細菌內膜的靶位來實現(xiàn)多重耐藥性[28]。另外, 高溫季節(jié)細菌大量增殖, 且水生動物對抗生素的吸收與溫度呈正相關[29-30]。而水溫與水生細菌多重耐藥性的形成是否存在關聯(lián), 有必要進一步深入研究。

2.4 水產養(yǎng)殖中抗生素的合理使用

由于養(yǎng)殖牡蠣的近海灣區(qū)富含各種浮游植物、無機鹽等營養(yǎng)物質, 因而是牡蠣生長的理想?yún)^(qū)。但離人類生活區(qū)較近, 人類活動殘留的抗生素沒有完全消除, 抗生素通過廢水排放和生物傳遞進入水生環(huán)境[31]。另外, 部分養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中濫用抗生素, 導致抗生素殘留在水體中。這過程中殘留的抗生素對細菌起到篩選的作用, 使細菌耐藥性不斷增強和擴散[32-33]。部分臨床醫(yī)學相關的致病菌如鮑曼不動桿菌, 其耐藥性正不斷擴散, 威脅人類和動物的健康[34]。絕大多數(shù)抗生素對細菌性疾病或真菌性疾病有效, 但是, 不同的細菌性疾病, 致病機理有所不同, 故所用的抗生素也不同[35]。因此我們在水產養(yǎng)殖的過程中對抗生素的使用要嚴格按照規(guī)定, 從養(yǎng)殖的實際情況出發(fā)合理使用抗生素。同時應該減少甚至禁止使用易于誘導細菌出現(xiàn)多重耐藥性的抗生素, 制定水產養(yǎng)殖過程中抗生素使用規(guī)范條例及科學標準, 建立有效的監(jiān)督機制。另一方面, 加強水生細菌的耐藥性的相關研究已刻不容緩, 尤其是多重耐藥性的形成機制以及耐藥傳播機理等方面。

3 結論

本文對廣東沿海地區(qū)6月、9月的香港牡蠣體內異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)分析表明牡蠣體內分離的異養(yǎng)細菌、弧菌多為嗜鹽性細菌, 其受溫度、鹽度影響較大。總體上, 9月份分離的異養(yǎng)細菌和弧菌比6月份高出1~2個數(shù)量級。310個菌株進行藥物敏感實驗發(fā)現(xiàn)80%的菌株的表現(xiàn)出多重耐藥性, 尤其對青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素的耐藥率都在50%以上。在水產養(yǎng)殖中分離多重耐藥細菌數(shù)量正逐年升高, 病害防治中應該對癥下藥, 減少甚至禁止使用易于誘導細菌出現(xiàn)多重耐藥性的抗生素。

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Investigation on the quantity and species of bacteria and their antibiotic resistance infrom the coast in Guangdong province

LI Bing1, 3, WANG Rui-xuan1, 2, XIE Yan-chun4, SHU Hu4, MOU Hong-li3, GUO Zi-han5, WANG Jiang-yong1, 3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306, China; 2. College of Food Technology and Life Science, Hanshan Normal University, Chaozhou, 521041, China; 3. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province; Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs South, Guangzhou 510300, China; 4. Guangzhou University, Guangzhou 510006, China; 5. California Baptist University, California 92504, USA)

Quantities of heterotrophic bacteria andspp. in oysters () from the coast of the Guangdong province during the high-temperature season (June and September) were analyzed. Antibiotic resistance of 310 bacterial strains isolated from medium containing different species with resistance to a single antibiotic, including gentamicin, furazolidone, rifampicin, ciprofloxacin, enrofloxacin, chloramphenicol, compound sulfamethoxazole, were further confirmed using the Kirby–Bauer method. Results showed that the 310 isolates belonged to 48 different species among the, andgenuses. The quantity of heterotrophic bacteria isolated from oysters in September was 1-2 orders of magnitude higher than that in June, with an exception of that in Taishan city. Heterotrophic bacteria quantities in oysters from the Taishan area peaked (2.6× 106to 5.8×106cfu/g) in June and were 1–3 orders of magnitude higher than those in other areas. Only 20 antibiotics were used for antibiotic susceptibility tests. Results showed that almost 310 strains were resistant to 20 antibiotics, with most strains resistant to penicillin, kanamycin, furazolidone, amoxicillin, clindamycin, and vancomycin. Multiple antibiotic resistance was widespread during the high-temperature period: 84.18% in June and 91.72% in September. Therefore, the present study provides an important reference for disease control in oyster farming and bacterial antibiotic resistance in aquaculture.

oysters; heterotrophic bacteria;; antibiotic resistance

Jul.14, 2019

S917.1

A

1000-3096(2020)03-0050-09

10.11759/hykx20191030001

2019-07-14;

2019-09-25

現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-49); 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室開放基金項目(201620411); 廣東省自然科學基金項目(2017A030313112)

[The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-49; Fund project of key laboratory of fishery environment of guangdong province, No.201620411; The Natural science foundation of Guangdong province, No. 2017A030313112]

(并列第1作者, 同等貢獻): 李炳(1995.10-), 男, 重慶璧山人, 碩士研究生, 主要從事細菌耐藥性研究 E-mail: 1029148315@ qq.com; 王瑞旋(1979.8-), 女, 廣東揭陽人, 副研究員, 博士, 主要從事水生生物病害防治 E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn;通訊作者:王江勇, E-mail: wjy104@163.com

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)