不同類型低溫體外循環對比的實驗研究

李 磊 徐孟輝 姜文劍 貢 鳴 許士俊 王曉龍 劉愚勇 李海洋 關欣亮 張宏家

體外循環(cardiac bypass,CPB)聯合低溫停循環 (hypothemic circulatory arrest,HCA)廣泛用于主動脈和復雜的先天性心臟病外科手術過程中[1-3]。然而HCA的最佳溫度選擇仍然存在爭議，既往研究鮮有涉及不同類型HCA對于腦損傷的大型動物類研究，有關HCA過程中病理生理學改變的研究更是少之又少。HCA的應用可以有效降低大腦代謝率，從而起到在術中保護大腦的作用[4-5]。據統計在應用HCA手術中，術后30 d死亡率及死亡校正后的永久性神經功能障礙發生率仍在19.4%和11.5%左右[6]。研究發現HCA通過誘導內皮細胞功能障礙、凋亡和壞死從而對中樞神經系統產生有害影響[7-8]。

獲得應用HCA患者的大腦標本是非常困難的，因此相關的動物實驗是必要的。通過對實驗動物應用HCA后大腦標本的系統性分析，可以為深入研究HCA相關腦損傷提供可靠證據。本研究目的是利用豬CPB模型中不同HCA類型大腦標本及血清學檢測比對結果，通過對相關結果的系統性分析從而發現何種類型HCA更適用于臨床需要。

資料與方法

所有實驗流程均按照北京安貞醫院倫理委員會批準的規程進行。實驗動物購于阜外醫院北京動物實驗中心，并按照國家科學院編制、國家衛生研究院出版的《實驗室動物護理與使用指南》進行護理。

1.實驗設計 13只豬(阜外醫院動物實驗中心,北京)被隨機分為對照組3只(36 ℃)、深低溫停循環組(DHCA鼻咽溫15 ℃)5只和中低溫停循環組(MHCA鼻咽溫25 ℃)。實驗組在實施麻醉、氣管插管及建立體外循環，對照組實施麻醉、氣管插管，并不建立體外循環，實驗結束后三組動物均進行解剖取標本。三組動物年齡及體質量無明顯差異[4～5個月/(100.2±5.1)kg]。停循環時間持續30 min，分別于10個時間點取血液樣本(圖1)。獲取血液標本儲存于肝素管中并搖勻。血液標本于4 ℃下3 000 r/min離心5 min，所得血清儲存于-80 ℃下，檢驗前血清于4 ℃下解凍并再次以3 000 r/min速度離心1 min。具體采血時間點如下：TI=麻醉開始; T2=降溫至32℃; T3=降溫至目標溫度; T4=停循環后30 min; T5=復溫至32℃; T6=復溫至36℃; T7=復溫至36℃后2 h; T8=復溫至36℃后4 h; T9=復溫至36℃后6 h; T10=復溫至36℃后24 h。實驗結束后通過矢狀面正中切口取出豬大腦標本。

圖1 溫度變化趨勢圖

2.實驗監測 于仰臥位，經股動脈置入動脈壓力導管進行血壓監測，經右股靜脈置入靜脈導管實施輸液和采血。采用內嵌式溫度探頭對鼻咽溫度進行監測。本實驗分析監測的血流動力學指標包括血壓、心率、氧分壓及ECG。

3.體外循環步驟 體外循環管路中預充明膠及乳酸鈉林格液，麻醉誘導后完全暴露心臟及升主動脈。肝素化后將體外循環管路分別置入升主動脈及右心房。手術過程經體外循環檢測系統(MDD, 93/42/EEC, UK)監護。低溫停循環的溫度由變溫水箱(MAQUET, HCU30, Germany)精確調節。體外循環建立后查紅細胞壓積為20～24%，期間血流維持在90～100 mL·kg-1·min-1，平均動脈壓維持在60～90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。鼻咽溫度降至32 ℃時，阻斷升主動脈，于升主動脈根部冠脈開口處灌注心臟停搏液。當鼻咽溫降至目標溫度時停止體外循環。于深低溫停循環組，降溫過程持續60 min左右，當鼻咽溫度達到15 ℃時，變溫水箱繼續運行，維持鼻咽溫度在15 ℃左右同時停止體外循環。低溫停循環30 min后，恢復體外循環運行，鼻咽部溫度復溫至37 ℃。待實驗對象血壓及心電波形穩定后，緩慢脫離體外循環并保持存活24 h。中低溫停循環組的操作步驟與深低溫停循環組相同，但其低溫停循環溫度更高(25 ℃)。

圖2 腦組織切片病理染色

4.標本檢測 獲取的大腦標本經石蠟包埋，并切成6 mm厚的切片。對這些標本行Bax、Bcl-2和Caspase3染色，以準確檢測腦損傷程度。切片使用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的檢測法(TUNEL assay kit, Sigma, No. 11684795910, USA)檢測凋亡細胞，操作流程嚴格按照操作說明書進行。經驗豐富的病理學家在高倍光學顯微鏡下對TUNEL陽性細胞進行計數，標本分組對病理學家不可見。凋亡指數計算方式為：隨機選取4個高倍視野(200倍放大)的區域并對其中凋亡細胞進行統計?？扇苄缘鞍? 100B (S-100B)是一種特異性表達于中樞神經系統的蛋白，有研究表明S-100B指標與大腦神經元損傷呈正相關。因此，本次實驗通過檢測血液病理情況下中能透過血腦屏障的S-100B水平來評估深低溫停循環所引起的腦損傷程度。本實驗還對所得血液樣本中的炎性因子(TNF-α、IL- 2及IL-6)，關鍵凝血因子(FXI、FVII)進行了Elisa檢測。

5.統計學方法 所有分析均采用SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL)系統分析，采用Kolmogorov-Smirnov方法檢測數據分布的正態性。計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析或Wilcoxon秩和檢驗對連續變量進行比較。分類數據以頻數及百分比的形式，并使用卡方檢驗或Fisher’s檢驗進行比較。采用Bonferroni校正分析的T檢驗比較多次測量的10個時間點。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.組織樣本分析 實驗組免疫組化染色(Bax、Bcl-2、Caspase 3)陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。實驗組內DHCA組與MHCA組(Bax、Bcl-2、Caspase 3)水平差異無統計意義(P>0.05，圖2)。同樣，TUNEL染色的陽性熒光直方圖顯示，對照組與實驗組間差異有統計意義(P<0.05)，但兩組差異無統計意義(P>0.05，圖3)。

腦組織切片分別行BAX、BCL-2、Caspase-3染色。統計藍色方框中的陽性因子，并繪制相應的直方圖。正常組與實驗組間差異有統計學意義(P<0.05)，實驗組間差異無統計學意義(P>0.05)

圖3 腦組織免疫熒光染色

采用DAPI GDNF和TUNEL評價腦神經元損傷程度。通過統計圖中綠色方框中TUNEL染色的熒光率并繪制直方圖，正常組與實驗組之間差異有統計學意義(P<0.05)，而兩個實驗組之間差異無統計學意義(P>0.05)

2.血液樣本分析 S-100B檢測結果如表1所示，T1～T4時間點兩組間結果比較，差異無統計意義(P>0.05)。雖然在MHCA組T5～T6時間點S-100 B出現短暫上升 (T5;P=0.02, T6;P=0.02), 但在隨后的T7～T10時間點S-100 B迅速恢復至與DHCA組相似水平(P>0.05)。炎癥因子變化如圖4所示，炎性因子(TNF-α、IL- 2及IL-6)在DHCA組與MHCA組內變化趨勢相似,差異無統計學意義(P>0.05)。凝血因子的變化如圖5所示，DHCA組與MHCA組關鍵凝血因子之間(FXI、FVII)比較發現差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組可溶性蛋白- 100B分析結果

討 論

近40年來，HCA廣泛應用于影響腦供血的外科手術中，其目的是在心血管外科手術中預防腦缺血相關損傷[9]。在大血管相關手術過程中，于HCA期間行主動脈弓的修復是目前外科專家的共識[10-12]。自從20世紀50年代DeBakey和Cooley實施主動脈弓部置換術以來[10-12]，不同類型的HCA分別被應用于該手術之中。當前常規HCA分為四種類型: 28.1～34 ℃為輕度低溫停循環，20.1～28 ℃為中度低溫停循環，14.1～20 ℃為深度低溫停循環和≤14 ℃的極度低溫停循環[14]。

在過去，DHCA因其顯著降低腦代謝率、興奮性遞質釋放、離子流入和血管通透性而受到外科醫生的青睞[15]。然而臨床研究證據表明，DHCA的降溫及復溫階段消耗大量時間，手術及體外循環時間延長引起的并發癥將會是一個嚴重的問題[16-18]。當前臨床醫生開始在主動脈弓部手術中選擇MHCA技術來減輕腦損傷，但是何種類型HCA可以最大程度的減輕大腦損傷尚未確定。在臨床實踐中，很難在手術后直接獲得腦部樣本，并且只能通過臨床癥狀間接的評估腦損傷的程度。在本研究中，我們使用了具有與人類類似遺傳特征的豬來構建HAC模型，手術后收集標本，并對標本進行病理分析。在比較實驗組大腦生物學參數的同時，本研究還系統、整體地研究了對照組腦損傷的程度，從而為選擇何種類型低溫停循環策略提供了理論依據。

目前，對于HCA后神經系統的變化已成為人們關注的話題，但是很少有研究在不進行腦灌注的情況下對神經元的損傷進行研究，在HCA期間應用選擇性腦灌注已成為減少神經損傷的一種策略[19]。大多數學者認為，伴有選擇性腦灌注的MHCA對神經系統具有與DHCA相似的保護功能[20]。Keeling等回顧了3 265例行順行腦灌注全主動脈弓置換術的患者，發現MHCA和DHCA組患者的神經系統并發癥或院內死亡率無差異[21]。Gong也得出了類似的結論[22]。此外，Arnaoutakis等發現，順行性腦灌注的MHCA患者似乎比逆行性腦灌注的DHCA患者預后結局更差[23]。為了獲得可靠的不同類型HCA對神經系統影響相關數據，在這項研究中我們并未應用選擇性腦灌注。

圖4 兩組不同時點炎性因子變化趨勢圖

圖5 兩組不同時點凝血因子變化趨勢圖 兩組間比較，*P<0.05

在本研究中，我們對位于TUNEL染色腦標本中的凋亡細胞進行了檢測并且計算其凋亡指數。Bax是一種與Bcl-2同源的水溶性蛋白質。Bax基因可促進細胞凋亡，屬于Bcl-2基因家族。Bcl-2可以抑制許多細胞毒性因子引起的細胞死亡，而Bax的過表達可以拮抗Bcl-2的保護作用并引起細胞死亡[24]。另外，已經有研究發現Bax與Bcl-2的比例是抑制細胞凋亡的關鍵因素。因此，我們使用免疫組織化學技術測量了腦細胞凋亡的水平，以確定其中凋亡相關蛋白(例如Bax，Bcl-2和Caspase-3)呈陽性的細胞數量。傳統理論認為，DHCA患者相對無腦灌注的MHCA患者，會得到更佳的腦保護[25]。但是，我們的結果顯示在腦組織凋亡測試中(Bax，Bcl-2和Caspase-3)，這兩組并沒有顯著差異。重要的是，在MHCA組中S-100B的水平恢復的很快，這表明，即是在沒有選擇性腦灌注的兩個實驗組之間腦損傷程度也是相似的。

TNF-α通過釋放一系列炎癥介質參與炎癥反應，它可以通過增加血管通透性并引起炎性細胞浸潤來導致組織損傷。因此，TNF-α被認為在缺血再灌注損傷中起著重要作用[26]。此外，IL-2是人類細胞免疫最重要的調節劑，IL-2的主要免疫調節作用包括：誘導NK細胞的增殖，刺激增強其自然殺傷作用，以及激活巨噬細胞和淋巴細胞[27-28]。血漿中的IL-6濃度與嚴重的腦損傷有關，血漿IL-6水平可預測腦損傷患者的短期預后[29]。我們隨后的研究表明，在兩個實驗組之間，炎癥因子的水平(包括TNF-α，IL-2和IL-6)無明顯差異，因此，可認為兩個實驗組之間的炎癥程度相似。由此，我們發現DHCA并未有效減輕炎癥，這與我們在二者腦組織樣本病理檢測并無差別的結果相符。

凝血因子Ⅺ被激活為絲氨酸蛋白酶，通過激活內源性凝血途徑促進凝血。人凝血因子VII是外源性凝血途徑的初始酶，它已被廣泛用于治療有出血傾向或血友病的患者[30]。我們的研究表明，與炎癥系統不同，凝血系統在溫度變化時會發生劇烈變化，在HCA期間和之后，凝血因子XI和凝血因子VII水平的變化尤為明顯，這與較低溫度可能抑制凝血系統功能的觀點一致。在這兩種凝血系統中，外源性凝血系統受低溫影響最嚴重。

實際上，我們的研究表明，DHCA并不能減輕更多的腦損傷，而且DHCA會伴有諸多并發癥，例如嚴重出血和對血液制品的需求增加[31]。我們的實驗還表明，即使在沒有腦灌注的情況下，適當升高溫度也不會增加炎癥反應?？傊?，與DHCA相比，MHCA需要的冷卻和復溫的時間更短，從而可能減少長時間的CPB所致的腦損傷。同時與DHCA相比，MHCA對凝血系統的影響要更小。另外，MHCA也沒有加重炎癥反應。 將來，應在更多的外科手術中使用MHCA，以避免DHCA的不利影響。

這項研究受到一些因素限制。在本實驗中，我們使用肝素抗凝管收集血液樣本，這可能對實驗結果有影響。由于大型動物實驗的高經費問題，我們只建立了15℃和25℃低溫停循環豬模型，沒有對其他溫度下或其他器官進行進一步的研究，對于其他溫度下豬腦保護的比較還有待深入研究。本研究雖最大限度模擬臨床，但所得結論仍需臨床深入驗證，并不能貿然應用于臨床實際。

總體來講，MHCA是一種具有與DHCA相似的優勢的方法，如損傷生物標志物水平和腦凋亡程度相似。兩者均與較低的腦血管神經事件發生風險相關。但是，MHCA對凝血系統的影響較小，并且與DHCA相比，需要的冷卻和復溫時間較短。該研究為MHCA在緊急主動脈弓修復中的臨床安全性和有效性提供了證據，表明MHCA比DHCA更合適于臨床實踐。

致謝我們感謝李嘉晨, 吳子寧, 裴昱強(首都醫科大學附屬北京安貞醫院-北京心肺血管疾病研究所)在稿件撰寫過程中對其進行了審閱與修改。