煙臺蘋果多酚的提取、分離及純化

李文前 董涵 張肖思睿 張振煒 劉序彥

摘? ?要：為分析煙臺各縣區7個示范果園的紅富士蘋果中多酚組成，文章采用微波輔助法提取蘋果中多酚，福林—酚比色法和鐵鹽催化法分別測定總酚及原花青素含量。結果表明，各鮮果中總酚含量為2.39～3.00 mg/g，原花青素含量占比在總酚中的含量在11.0%～12.4%。其中以煙臺棲霞區紅富士蘋果為最佳。經Sephadex G25精制后蘋果多酚總酚得率為0.25%。煙臺紅富士蘋果多酚含量高，營養豐富，食用和藥用價值良好。對于煙臺蘋果的深加工和提升附加值具有一定的的理論意義和應用價值。

關鍵詞：煙臺蘋果;微波提取;多酚;原花青素

蘋果多酚是植物多酚的一種，是蘋果中所含多元酚類物質的通稱，在皮、肉和核中都存在。化學性質和生理功能性質穩定，可在室溫下長期保存，其易溶于水和乙醇，產品可進行深加工，營養價值和醫療價值都很高。研究表明蘋果中的酚類物質主要包括：類黃酮、綠原酸、兒茶素等。利用“蘋果多酚”的抗氧化作用可以對抗紫外線照射后產生的活性氧的危害，保護美麗肌膚。另外，對于黑色素生成，肌膚美白也有一定作用。同時，蘋果多酚化合物還可以通過誘導細胞的“自殺”作用，抑制細胞增殖和腫瘤增大，并發現原花青素是蘋果多酚化合物中抗癌的有效成分，用于牙膏中，既有防蛀齒作用又有潔齒作用，同時其有抑制高血壓、高血脂及心腦血管疾病的作用，是有效的高血壓、高血脂及心腦血管疾病的制藥劑。被人譽為是“天然降壓藥”，因此對蘋果多酚的提取、分離及純化方面的研究具有一定的價值。

我國是重要的蘋果生產國，其中山東煙臺地區的蘋果栽培歷史悠久，是中國蘋果栽培最早的地方，有140多年的歷史，被稱為中國現代蘋果的發源地。煙臺氣候和環境條件非常適宜蘋果生長，被農業部確定為中國蘋果優勢產區，煙臺蘋果以“果形端正、色澤艷麗、果肉甜脆、香氣濃郁”享譽國內外。以煙臺轄區內的長島、龍口、棲霞、萊陽、萊州、蓬萊、招遠等地栽培的蘋果為煙臺市的區域公用品牌。但是對煙臺蘋果多酚的進一步提取純化及含量研究未見報道。

因此，本文通過微波提取技術對煙臺7個有代表性的縣區蘋果的多酚及原花青素含量進行測定和對比分析，為煙臺蘋果多酚的產業化提供數據參考，對于煙臺蘋果的深加工和提升附加值具有一定的理論意義和應用價值。

1? ? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

山東煙臺紅富士蘋果分別購買于煙臺轄區內的長島、龍口、棲霞、萊陽、萊州、蓬萊、招遠，編號01—07。陜西洛川紅富士編號08用以做對比。沒食子酸標準品購買于上海源葉生物科技有限公司、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、Folin-ciocalteui試劑（自制：在1l磨口回流蒸餾器中加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4），25 g鉬酸鈉Na2MoO4），700 mL蒸餾水，50 mL 85%磷酸，100 mL 37%鹽酸（HCl），冷凝回流10 h，然后添加150 g硫酸鋰（Li2SO4）和數滴溴液（Br2），取下冷凝管，重新加熱至沸，維持15 min，除去多余溴，冷卻后補足蒸餾水至1 000 mL，用棕色試劑瓶裝好，置于冰箱中長期冷藏備用，臨用時稀釋3倍）。

1.2? 方法

1.2.1? 多酚提取

準確稱取蘋果渣2.0 g于250 mL錐形瓶中，采用微波提取，提取條件：萃取時間60 s;功率750 W;乙醇濃度60%;料液比1：50。提取后4 000 r/min，20 min離心，取上層離心液定容到50 mL。

1.2.2? 總酚含量測定

以沒食子酸為標準物質，采用福林—酚比色法測定蘋果中總酚的含量。

測定方法根據參考文獻修改如下：準確稱量干燥至恒重的沒食子酸標準品0.1 g，配制成濃度為100 μg/mL的標準液。分別量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0 mL，7.0 mL沒食子酸標準液于25 mL棕色容量瓶中，然后分別加入福林—酚試劑1.0 mL，混勻后加入10%碳酸鈉溶液5.0 mL，充分混勻，定容到25 mL，30 ℃遮光反應1 h，于765 nm測定吸光值，繪制沒食子酸標準曲線y=0.022 5x+0.006 1，R?=0.998 2。

1.2.3? 樣品測定

量取多酚提取液2 mL于25 mL棕色容量瓶中，按照標準曲線測定方法，測定蘋果多酚含量。

1.2.4? 蘋果提取物中原花青素含量的測定

將1.2.1中配置好的2 mL多酚提取物，用甲醇溶解后定容至25 mL，然后取1 mL樣液加入具塞試管中，再依次加入6 mL正丁醇/鹽酸溶液（體積比為95/5），0.2 mL硫酸鐵銨溶液（0.024 g/mL），于沸水中加熱40 min后迅速冷卻，以試劑空白作參比，然后在546 nm處測定其吸光度。

1.2.5? 葡聚糖凝膠Sephadex G25預處理

Sephadex G25屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質，適合于不同類型有機物的分離，并且性質穩定，易實施循環操作。

樣液上柱后用蒸餾水洗脫，流速1 mL/min，每4 min收集一次洗脫液，1～10為水洗液，10管后采用70%的乙醇以0.5 mL/min的流速進行洗脫，每管按照0.5 mL/min的量收集洗脫液，然后逐管分別進行多酚的測定。

2? ? 結果分析

2.1? 總酚質量分數

如圖1所示，煙臺7個縣區（01～07）樣果中鮮果蘋果多酚質量分數為2.388～2.998 mg/g，與08陜西洛川紅富士蘋果對比分析可知，煙臺紅富士蘋果中總體多酚質量分數較高，其中棲霞區蘋果多酚質量分數最高為2.998 mg/g。

2.2? 原花青素質量分數

如圖2所示，在煙臺紅富士（01—07）蘋果中原花青素質量分數在0.278～0.372 mg/g，由表3可知原花青素在總酚中的占比為11.0%～12.4%，其中棲霞（03）紅富士總酚中原花青素質量分數最高達到12.4%，陜西洛川（08）紅富士總酚中原花青素質量分數可達12.2%。因為原花青素有一定的抗氧化性以及醫用價值，為煙臺蘋果多酚中單體的提取和純化提供了一定的理論依據。各區原花青素在總酚中的占比如表1所示。

2.3? 蘋果多酚的精制

結果如圖3所示，從中可以看出比較明顯的峰有8個，其中最早出現的峰多酚含量較少，自18管之后多酚的含量明顯增加，18～42管之間為多酚分布的高峰區間，合并18管之后的洗脫液進行含量測定。經Sephadex G25精制后的蘋果多酚，經冷凍干燥處理得到產品蘋果多酚粉末，蘋果多酚總酚得率為0.25%。

3? ? 結語

文章研究了山東煙臺7個地區紅富士蘋果的多酚及原花青素質量分數，從實驗中可知煙臺區紅富士蘋果中多酚質量分數為2.388～2.998 mg/g，原花青素質量分數占比在總酚中的質量分數在11.0%～12.4%，其中棲霞（03）紅富士總酚和原花青素質量分數最高分別為2.998 mg/g和12.4%。與洛川（08）紅富士蘋果對比可知，煙臺紅富士因其栽培蘋果歷史悠久，水土、氣候等條件利于蘋果的生長所以其總酚質量分數明顯高于洛川紅富士，但是二者中原花青素含量占比都很高可達12%左右。經Sephadex G25精制后的蘋果多酚總酚得率為0.25%。