多壁碳納米管凈化-超高效液相色譜串聯質譜法測定香蕉中8種新煙堿類殺蟲劑

樂淵 鄧正敏 劉春華 吳南村

摘要：建立基于多壁碳納米管凈化、超高效液相色譜串聯質譜技術同時測定香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的分析方法。香蕉樣品中用含1%乙酸的乙腈提取后，經多壁碳納米管凈化后，用超高效液相色譜-串聯質譜法測定。呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的質量濃度在0.005～0.200 mg/L范圍內線性良好，最低檢出限在0.03～0.44 μg/kg 之間，相關系數均大于0.99，平均加標回收率在75.2%～114.9%之間，相對標準差在0.3%～9.5%之間。與N-丙基乙二胺和石墨化碳黑吸附劑相比，多壁碳納米管具有凈化效果好和效率高等優點。方法學考察及實際樣品的測定證明該方法簡便、快速、準確，可用于香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的檢測。

關鍵詞：香蕉;新煙堿類殺蟲劑;多壁碳納米管;超高效液相色譜-串聯質譜;加標回收率;殘留量

中圖分類號：S481+.8?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0181-05

收稿日期：2018-11-22

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-31-13）;熱帶農產品質量安全科技創新團隊項目（編號：1630082017002）。

作者簡介：樂?淵（1985—），男，江西撫州人，碩士，助理研究員，主要從事農產品質量安全研究。E-mail：leyuan06@sina.com。

新煙堿類殺蟲劑作用于昆蟲神經系統突觸后膜的煙堿乙酰膽堿受體及其周圍的神經，使昆蟲保持興奮、麻痹而后死亡[1]，由于具有高效率、高選擇性、高持效性和對哺乳動物低毒等特點而被廣泛應用于農業生產中，在香蕉生產中也可用于防治薊馬、紅蜘蛛、夜蛾、香蕉象甲等害蟲[2-3]。近年來研究表明，新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂、家蠶和蚯蚓等非靶標生物存在較大毒性，且在香蕉生產過程中過量使用或濫用殺蟲劑會造成果實中存在農藥殘留，易引發生態環境系統和農產品質量安全問題[4-6]。因此，開發香蕉中新煙堿類殺蟲劑分析方法對于保障香蕉產品質量安全和消費者健康具有重要意義。

美國農業部Anastassiades等開發的QuEChERS方法是目前各實驗室中常用的農藥多殘留分析的前處理方法，包含液液萃取和微型的固相分散萃取等2個步驟[7]。QuEChERS方法的優點是效率高、適用性好和有機溶劑使用量少，但也存在凈化能力弱的缺點。為改善QuEChERS方法的凈化能力，在常用的N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）等吸附材料之外，研究新吸附材料成為熱點。多壁碳納米管（MWCNTs）憑借比表面積大、吸附性能好等優點受到研究者的關注，并被應用于農藥殘留檢測領域[8-10]。本研究采用多壁碳納米管作為吸附材料，結合液相色譜-串聯質譜儀的可分析農藥范圍廣、靈敏度高和選擇性好等特點，探討建立測定香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的改進型QuEChERS方法。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

主要的試驗儀器有TripleQuad 4500超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜儀配有電噴霧離子源（ESI）和Analyst 1.6.3工作站（美國應用生物系統公司）、ACQUITY_ UPLCTM BEH C18 1.7 μm×2.1 mm×50 mm 色譜柱[沃世特科技（上海）有限公司]、AL204型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]、VS-24SMTi型離心機（美國VISION公司）。

主要的試劑有呋蟲胺、烯啶蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻蟲胺、啶蟲脒、氟啶蟲胺腈、噻蟲啉等8種農藥標準品（農業農村部環境保護科研監測所，純度≥99%）;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（美國Fisher公司，色譜純）;多壁碳納米管（天津博納艾杰爾科技有限公司）外徑為10～20 nm，內徑為5 nm，長度為5～15 μm，使用前在120 ℃下加熱3 h去除殘留的水份;石墨化碳黑吸附劑（GCB）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）（美國安捷倫科技公司）;乙酸銨、乙酸鈉、氯化鈉（廣州化學試劑廠）;無水硫酸鎂[西格瑪-奧德里奇（上海）貿易有限公司];檸檬酸鈉和檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（上海阿拉丁生物科技股份有限公司）;試驗用水為經Milli-Q凈化系統0.22 μm過濾膜過濾的純化水;香蕉樣品購自本地超市和水果批發市場。

1.2?標準溶液的配制

1.2.1?儲備液的配制?將呋蟲胺等8種農藥用乙腈配制成濃度為10 mg/L的混合標準儲備液，在-18 ℃下避光保存，有效期為1個月。

1.2.2?標準溶液的配制?將上述標準儲備液用乙腈稀釋成濃度為0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L的系列混合標準溶液，現配現用。取空白香蕉樣品按1.3方法進行前處理，得到空白香蕉基質溶液。氮吹至近干后，用1 mL相應濃度乙腈配制的標準溶液定容，得到基質匹配標準溶液。

1.3?樣品前處理

香蕉樣品（分為全蕉和蕉肉2份）用組織搗碎機搗碎，裝入潔凈容器內，作為試樣密封并于-18 ℃ 下保存。

準確稱取10.00 g均質試樣于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈（含1%乙酸）、1.0 g乙酸鈉、4.0 g無水硫酸鎂和1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min。然后以5 000 r/min的轉速離心5 min。取上清液1.00 mL于預先稱有5 mg多壁碳納米管和150 mg無水硫酸鎂的15 mL離心管中，渦旋1 min，再以5 000 r/min的轉速離心5 min。上清液經0.22 μm 聚四氟乙烯微孔膜過濾，待超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）分析。

1.4?儀器工作條件

超高效液相色譜工作條件：流動相A為水，流動相B為甲醇;柱溫為35 ℃;樣品室溫度為15 ℃;進樣體積為3 μL;流速為0.25 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

質譜工作條件：離子源電噴霧;離子化電壓為5 500 V;溫度為500 ℃;氣簾氣壓力為207 kPa;噴霧氣壓力為379 kPa;輔助加熱氣壓力為379 kPa;碰撞氣壓力為55 kPa。多反應監測模式下的質譜參數見表2。

2?結果與分析

2.1?UPLC-MS/MS工作條件的優化

在電噴霧離子源電離模式下，以流動注射方式分別對呋蟲胺等8種殺蟲劑的單標溶液進行母離子全掃描，再對各自的子離子進行全掃描，每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并進行質譜多反應監測（MRM）參數的優化，優化結果見表2。

在上述質譜條件下，測試甲醇-0.02%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液、乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-2 mmol/L 氨水溶液、甲醇-水等5種流動相體系。結果表明，當使用乙腈作為有機相時，大部分化合物色譜分離度不理想，集中在2～3 min時間段內出峰。當使用甲醇-水流動相體系時各化合物的分離度較好且響應值最高，其中吡蟲啉、呋蟲胺、烯啶蟲胺和噻蟲啉較甲醇-甲酸水溶液和甲醇-乙酸銨水溶液體系提高約3倍。因此，本試驗采用甲醇-水作為流動相。圖1為MRM模式下0.05 mg/L 標準溶液的提取離子流色譜。

2.2?提取條件的選擇

由于乙腈的通用性強，對農藥的溶解度大，試驗選擇乙腈作為提取溶劑。為改善一些對pH值較為敏感的農藥的檢測，QuEChERS方法中常加入醋酸鹽緩沖體系或檸檬酸鹽緩沖體系[11-12]。試驗嘗試了在提取過程中加入上述2種緩沖鹽體系，與純乙腈溶液作為參照，對提取效率進行比較。試驗在香蕉空白樣品中添加適量標準溶液（添加量為50 μg/kg），提取后不經凈化直接用UPLC-MS/MS測定。條件1：提取溶劑為純乙腈，后加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉;條件2：提取溶劑為含1%乙酸的乙腈溶液，后加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g 乙酸鈉;條件3：提取溶劑為乙腈，后加入4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g二水檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物。結果表明，條件2的8種殺蟲劑的提取效率最高，呋蟲胺和烯啶蟲胺比條件1高約50%，比條件3高20%;其他6種殺蟲劑比條件2、3高約10%。因此，本試驗選擇添加醋酸鹽緩沖體系的乙腈作為提取條件。

2.3?凈化條件的選擇

為考察MWCNTs、PSA和GCB對香蕉提取液的凈化效果，分別取1 mL香蕉提取液，用3種條件進行凈化：（1）5 mg MWCNTs+150 mg無水硫酸鎂;（2）50 mg PSA+150 mg無水硫酸鎂;（3）10 mg GCB+150 mg無水硫酸鎂。參照文獻[13]對色素凈化效果進行考察，結果如圖2所示。PSA對色素幾乎無凈化效果，10 mg GCB凈化了96%的葉黃素和全部的葉綠素，5 mg MWCNTs凈化了99%的葉黃素和全部的葉綠素。與GCB相比，MWCNTs比表面積更大，還具有中空結構，凈化效率更高。因此，本試驗選擇5 mg MWCNTs+150 mg無水硫酸鎂作為凈化條件。

2.4?方法的線性范圍和檢出限

按“1.2.2”節配制一系列濃度的呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑香蕉基質匹配標準溶液，采用“1.4”節中的方法進行測定，以儀器響應值峰面積對各目標物的質量濃度進行線性回歸。結果表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的質量濃度在0.005～0.200 mg/L范圍內線性良好，相關系數和回歸方程見表3。

以滿足方法學要求的最低添加回收水平作為定量限，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在全蕉和蕉肉中的定量限均為5 μg/kg。檢出限采用樣品加標方式測定并計算，加標樣品經“1.3”節處理后測定，以8種殺蟲劑檢測信號為3倍基線噪音時的添加濃度為方法檢出限，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的檢出限見表3。

2.5?方法的精密度和回收率

取空白香蕉樣品，按5、10、50 μg/kg 3個水平進行加標試驗，按“1.3”節進行前處理，平行測定6次，作回收率和精密度試驗。結果（表4）表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在全蕉中平均回收率在80.2%～114.9%之間，相對標準差在0.3%～3.5% 之間;在蕉肉中平均回收率在75.2%～102.0% 之間，相對標準差在0.5%～9.5%之間;均滿足NY/T 788—2004《農藥殘留試驗準則》中農藥殘留分析方法要求[14]。

2.6?基質效應

基質效應是指樣品分析液中除分析物以外的共流出組分改變了分析物的響應值，從而影響定量分析的準確度和重現性，其機制可能是共流出組分影響了電噴霧接口的離子化效率[15]。通過測定呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑在香蕉基質匹配標準溶液中校正曲線的斜率（A）及其在純溶劑標準溶液中校正曲線的斜率（B），得到基質效應（matrix effect，簡稱ME）=（A-B）/B×100%。若ME>0，則表示基質對分析物的響應產生增強效應;若ME<0，則表示基質對分析物的響應產生抑制效應;若ME=0，則表示不存在基質效應。當-20%≤ME≤20%時，基質干擾程度較低;當-50%≤ME<-20% 或20%50%，表示基質干擾程度強烈[16]。表5為香蕉基質中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑的基質效應。

結果表明，呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑均表現為基質抑制效應。在全蕉中，噻蟲啉干擾程度較低，啶蟲脒、噻蟲嗪、呋蟲胺、烯啶蟲胺和氟啶蟲胺腈等5種殺蟲劑表現為中等程度的基質干擾效應，吡蟲啉、噻蟲啉基質效應干擾強烈。在蕉肉中，8種新煙堿類殺蟲劑基質干擾程度均較低。

為消除基質效應所帶來的干擾，提高分析結果的準確度，常采用標準加入法、基質匹配標準溶液、使用分析保護試劑和同位素內標法等[17-18]。在農藥殘留分析中，最常見的是用基質匹配標準溶液進行消除。從分析結果可知，當只須要測定全蕉中噻蟲啉和蕉肉中8種新煙堿類殺蟲劑時，由于基質效應較弱可直接使用溶劑標準溶液進行定量;當須要測定全蕉中其他7種新煙堿類殺蟲劑時，就須要使用基質匹配標準溶液，才能定量準確。

2.7?實際樣品的測定

采用本試驗建立的方法測定采集于本地4個超市和1個水果批發市場的15份香蕉樣品。其中2份全蕉樣品檢出啶蟲脒，含量分別為0.040、0.012 mg/kg，均低于《GB 2763—2016?食品安全國家標準?食品中農藥殘留最大限量》中規定的最大殘留限量值2 mg/kg[19]。相應的蕉肉樣品中啶蟲脒為未檢出，表明啶蟲脒主要殘留于香蕉果皮中。其他樣品均未檢出呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑。

3?結論

本研究建立一種基于多壁碳納米管的凈化方法，結合UPLC-MS/MS的高分辨能力來快速檢測香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量。與N- 丙基乙二胺和石墨化碳黑等吸附劑相比，多壁碳納米管具有色素凈化效果好、效率高等優點。本試驗優化了超高效液相色譜與質譜的采集參數并考察了基質效應，方法學考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準確度高等優點，可用于香蕉中呋蟲胺等8種新煙堿類殺蟲劑殘留量的檢測，具有一定的推廣價值。在香蕉生產過程中使用的農藥，除新煙堿類殺蟲劑外還包括有機磷類、菊酯類殺蟲劑、殺菌劑和植物生長調節劑等，將該方法延伸至更多目標物，能有效提高食品安全檢測效率，將會是未來研究的一個關注點。

參考文獻：

[1]Goulson D. Review：an overview of the environmental risks posed by neonicotinoid insecticides[J]. Journal of Applied Ecology，2013，50（4）：977-987.

[2]李?強，付步禮，邱海燕，等. 滴灌施藥技術防治香蕉黃胸薊馬應用展望[J]. 農學學報，2018，8（4）：14-18.

[3]Poulsen M E，Andersen J H，Petersen A，et al. Results from the Danish monitoring programme for pesticide residues from the period 2004—2011[J]. Food Control，2017，74：25-33.

[4]Tosi S，Burgio G，Nieh J C. A common neonicotinoid pesticide，thiamethoxam，impairs honey bee flight ability[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：1201.

[5]袁?銳，李麗莉，李?超，等. 六種新煙堿類殺蟲劑對凹唇壁蜂的毒性及風險評估[J]. 昆蟲學報，2018，61（8）：950-956.

[6]李田田，鄭珊珊，王?晶，等. 新煙堿類農藥的污染現狀及轉化行為研究進展[J]. 生態毒理學報，2018，13（4）：9-21.

[7]Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaher D，et al. Fast and easy multi-residue method employing acetonitrile extraction/partitioning an“dispersive solid-phase extraction”for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International，2003，86（2）：412-431.

[8]Hou X，Lei S，Qiu S，et al. A multi-residue method for the determination of pesticides in tea using multi-walled carbon nanotubes as a dispersive solid phase extraction absorbent[J]. Food Chemistry，2014，153：121-129.

[9]Jakubus A，Tyma M，Stepnowski P，et al. Application of passive sampling devices based on multi-walled carbon nanotubes for the isolation of selected pharmaceuticals and phenolic compounds in water samples - possibilities and limitations[J]. Talanta，2017，164：700-707.

[10]HanZ，JiangK，FanZ，etal.Multi-walledcarbonnanotubes-

based magnetic solid-phase extraction for the determination of zearalenone and its derivatives in maize by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Control，2017，79：177-184.

[11]Lehotay S J. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate：collaborative study[J]. Journal of AOAC International，2007，90（2）：485-520.

[12]Foods of plant origin-Determination of pesticide residues usingGC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE-QuEChERS-method：European Standard EN 15662[S]. Brussels：Europe and Committee for Standardization，2008.

[13]田海英，韋鳳杰，張東豫，等. RP-HPLC法測定煙草中的質體色素[J]. 煙草科技，2009（4）：32-36.

[14]農藥殘留試驗準則：NY/T 788—2004[S]. 北京：中國農業出版社，2004.

[15]Kruve A，Künnapas A，Herodes K，et al. Matrix effects in pesticide multi-residue analysis by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2008，1187（1/2）：58-66.

[16]劉進璽，秦珊珊，馮書惠，等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定食用菌中農藥多殘留的基質效應[J]. 食品科學，2016，37（18）：171-177.

[17]Garrido F A，Martínez V J L，Fernández M J L，et al. Compensation for matrix effects in gas chromatography-tandem mass spectrometry using a single point standardaddition[J]. Journal of Chromatography A，2009，1216（23）：4798-4808.

[18]Martínez-Galera M，López-López T，Gil-García M D，et al. A comparative study of the correction of systematic errors in the quantitation of pyrethroids in vegetables using calibration curves prepared using standards in pure solvent[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2003，375（5）：653-660.

[19]食品安全國家標準?食品中農藥殘留最大限量：GB 2763—2016[S]. 北京：中國標準出版社，2017.