重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)檢測創(chuàng)傷弧菌

凌莉 席靜 王瑩 周廣彪 劉婧文 魏霜 李志勇

摘要：為建立創(chuàng)傷弧菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）檢測方法，根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白（Gyrase Beta Subunit，gryB）的基因保守序列，設(shè)計(jì)RPA特異性引物，建立創(chuàng)傷弧菌gryB基因的RPA檢測方法并測試其特異性、靈敏度和應(yīng)用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，建立的RPA檢測方法特異性好，能夠從創(chuàng)傷弧菌中檢測到234 bp的特異性條帶，僅需在37 ℃下恒溫反應(yīng)40 min，不需要特殊的儀器設(shè)備;該方法的靈敏度與PCR相當(dāng)，可達(dá)到0.1 ng/μL，應(yīng)用檢測結(jié)果也表明該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相當(dāng)。因此，本研究建立的RPA方法檢測gryB特異性強(qiáng)、靈敏度高，無需特殊的儀器設(shè)備，適合實(shí)驗(yàn)室快速檢測。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷弧菌;gryB基因;RPA;檢測

中圖分類號：S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0073-04

收稿日期：2018-12-06

基金項(xiàng)目：廣東省基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：S2012030006235）;廣東省科技計(jì)劃（編號：2016A050503031）;廣東出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局科技計(jì)劃（編號：2017GDK48）;廣東省汕頭市科技計(jì)劃（編號：汕府科[2017]166號-38）。

作者簡介：凌?莉（1978—），女，廣東人，碩士，高級工程師，主要從事食品安全研究。E-mail：joiceling@163.com。

通信作者：李志勇，博士，研究員，主要從事食品安全研究。E-mail：lizy@iqtc.cn。

創(chuàng)傷弧菌是一種帶有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，在海水養(yǎng)殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動物中分布廣泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一[1-2]。人食用生的或未經(jīng)充分加工的海產(chǎn)品，以及通過皮膚創(chuàng)口接觸海水入血均可感染，并在短時間內(nèi)出現(xiàn)敗血癥“蜂窩組織炎”出血性大疤，半數(shù)以上患者可因多臟器功能衰竭而死亡，因此創(chuàng)傷弧菌又被稱為“海洋中的無聲殺手”[3]。當(dāng)下世界上大部分沿海國家均有創(chuàng)傷弧菌的致病報(bào)道，我國江浙、閩粵沿海及臺灣地區(qū)亦有較多的感染報(bào)道，更有數(shù)例因創(chuàng)傷弧菌感染引起的敗血癥患者，在3～4 d內(nèi)均出現(xiàn)腹腔內(nèi)廣泛性壞死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公眾飲食健康的重大威脅之一，所以對創(chuàng)傷弧菌的檢測在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義[4]。

目前，對創(chuàng)傷弧菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在檢測效率低、檢測目標(biāo)單一、靈敏度低且耗時長、操作繁瑣等不足。為滿足致病菌快速檢測的要求，技術(shù)人員發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測法（VIDAS-CHL）、酶免疫法（EIA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、膠體金試紙條法、API生化鑒定試紙條法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)和實(shí)時熒光PCR等方法。其中，實(shí)時熒光PCR及PCR相關(guān)的其他改良技術(shù)以操作簡便快捷、靈敏度高等顯著優(yōu)勢，近年來在致病菌檢測中的應(yīng)用越來越廣泛[5]，但熒光檢測設(shè)備普遍售價偏高、產(chǎn)物片段偏小、引物探針設(shè)計(jì)要求較高等不可回避的缺陷，在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用，尤其是不利于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場檢測以及基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。

RPA（recombinase polymerase amplifcation）是繼LAMP之后的另一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[6]，該技術(shù)擴(kuò)增利用單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）將雙鏈模板DNA解鏈，在DNA聚合酶的作用下，引物與特定模板正確配對形成復(fù)合體，然后由DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA互補(bǔ)鏈。該方法主要具備以下優(yōu)點(diǎn)：（1）恒溫37 ℃下即可反應(yīng)，不需要高低溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn)核酸解鏈和退火;（2）只需要1對引物，反應(yīng)時間短，僅需40 min;（3）結(jié)果易辨識，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物具有特定大小的條帶[7]，而且還可進(jìn)行進(jìn)一步的測序確認(rèn)。

目前，國內(nèi)尚未見到利用RPA技術(shù)檢測創(chuàng)傷弧菌的報(bào)道，本研究擬根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白（Gyrase Beta Subunit）的gryB基因，設(shè)計(jì)RPA檢測引物，構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測方法，并驗(yàn)證其特異性和靈敏度，建立一種快速檢測創(chuàng)傷弧菌gryB的簡便高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適于現(xiàn)場應(yīng)用檢測的技術(shù)方法。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、擬態(tài)弧菌（ATCC33653）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC39315）、哈維氏弧菌（ATCC33842）、沙門氏菌（ATCC14028）、大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和單增李斯特菌（ATCC19114）均為本機(jī)構(gòu)購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其購買來源為中國科學(xué)院水生生物研究所、廣東食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心和美國MBL公司。應(yīng)用檢測的樣品均為本機(jī)構(gòu)2016年法定和委托檢驗(yàn)中的留樣，所用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)（貨號DP302），引物由上海生物工程技術(shù)有限公司安排合成，電泳級瓊脂糖、DNA Marker及顯色劑購自寶生物大連生物技術(shù)有限公司，RPA擴(kuò)增試劑盒為TwistDX公司產(chǎn)TwistAmp Basic kits。

1.2?主要儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀（Veriti，ABI公司）、核酸蛋白分析儀（ND-1000，Thermo公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1 600，天能公司）。

1.3?方法

1.3.1?基因組DNA提取

先將上述標(biāo)準(zhǔn)菌株按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789進(jìn)行復(fù)壯增菌及生化鑒定，再參照試劑盒說明書，提取上述增菌液的基因組DNA，使用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及純度并統(tǒng)一稀釋為100 ng/μL備用。

1.3.2?引物設(shè)計(jì)

參考RPA引物設(shè)計(jì)的要求，根據(jù)gryB基因的保守序列，使用Oligo V6.22軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選，入選序列再利用Primer Blast工具（NCBI官方網(wǎng)站提供）進(jìn)行特異性確認(rèn)，最終交由上海生物工程技術(shù)有限公司安排合成。最終設(shè)計(jì)檢測創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測引物，擴(kuò)增條帶234 bp，序列具體如下：上游引物：5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′;下游引物：5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTGCTAT-3′。

1.3.3?RPA檢測方法建立

以“1.3.1”節(jié)中制備的DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時設(shè)置超純水為陰性對照，測試恒溫37 ℃反應(yīng)時長分別為30、40、50、60 min時的擴(kuò)增效果。RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2 mL Twist Amp反應(yīng)管（Twist AmpBasic kits，Twist）中加入再水化緩沖液（Rehydration Buffer）29.5 μL，去離子水12.5 μL，上、下游引物各2 μL（終濃度為0.4 μmol/L），模板DNA 1.0 μL，最后再加入醋酸鎂溶液2.5 μL（280 mmol/L）。RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50.0 μL苯酚/氯仿溶液，充分混勻后12 000 r/min離心2 min，取上清液5 μL點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，使用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳，電泳條件為5 V/cm，恒壓電泳40～60 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3.4?RPA檢測方法特異性評價

按照“1.3.3”節(jié)的RPA檢測反應(yīng)體系及適用擴(kuò)增時長，對前述11種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA進(jìn)行檢測，對所建立的RPA檢測方法特異性進(jìn)行評價。

1.3.5?RPA檢測方法靈敏度評價

將創(chuàng)傷弧菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，共5個稀釋度，以梯度稀釋的DNA為模板，按照“1.3.3”節(jié)所示RPA檢測反應(yīng)體系進(jìn)行RPA靈敏度試驗(yàn)，并與蔣蔚等報(bào)道的PCR檢測方法的靈敏度[8]進(jìn)行比較，評價RPA檢測方法的靈敏度。

1.3.6?RPA檢測方法應(yīng)用效果評價

選取本機(jī)構(gòu)2016年檢測留樣樣品50份，包括20份陽性樣品，其中創(chuàng)傷弧菌確認(rèn)陽性檢出2份。樣品主要為凍蝦仁、凍鳳尾對蝦、凍牡蠣、活青蟹、金鯧魚以及水質(zhì)監(jiān)控樣本，參考食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品處理，使用堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)10 h，取2 mL 增菌液離心富集，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP302）提取DNA，使用建立的RPA方法進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)，以結(jié)果的一致性來評價方法的應(yīng)用效果。

2?結(jié)果與分析

2.1?RPA檢測方法的構(gòu)建

以創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，并以超純水為陰性對照，測試了不同擴(kuò)增時長的RPA檢測效果，由圖1可知，在40 min時便可達(dá)到較為理想的擴(kuò)增效果，gryB擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶大小一致，約234 bp，陰性對照沒有條帶，建立的RPA檢測體系能夠準(zhǔn)確檢測到gryB基因。

2.2?RPA檢測方法的特異性評價

由圖2可知，gryB的RPA特異性評價結(jié)果顯示，創(chuàng)傷弧菌能夠檢測到234 bp的特異性條帶，其他10株標(biāo)準(zhǔn)菌株：擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均未檢測到條帶，說明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.3?RPA檢測方法的靈敏度評價

靈敏度測試結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)RPA檢測方法反應(yīng)時間為40 min，DNA含量為0.1 ng時，可檢測234 bp大小目的條帶，該靈敏度結(jié)果與蔣蔚等建立的檢測創(chuàng)傷弧菌groEL基因的PCR方法一致;當(dāng)DNA含量為0.01 ng時，2種方法均未能擴(kuò)增到目的條帶，說明RPA方法與PCR方法的靈敏度相當(dāng)。

2.4?RPA檢測方法的應(yīng)用效果

應(yīng)用建立的RPA檢測方法，對本機(jī)構(gòu)2016年檢測的20份陽性檢出留樣（其中創(chuàng)傷弧菌確認(rèn)陽性檢出2份）和30份陰性留樣進(jìn)行了復(fù)檢，結(jié)果共有2份樣本檢出創(chuàng)傷弧菌，該留樣檢測結(jié)果與之前傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定的結(jié)果完全一致，表明該方法具有較好的應(yīng)用效果。

3?討論

RPA技術(shù)是近些年興起的常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，目前在病毒、病原菌及轉(zhuǎn)基因的檢測中均有成功應(yīng)用的先例[8-14]，但尚未見創(chuàng)傷弧菌的相關(guān)研究報(bào)道。本研究建立了針對創(chuàng)傷弧菌特異性gryB基因的RPA檢測方法，并對該方法進(jìn)行了應(yīng)用測試，結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)，靈敏度與普通PCR相當(dāng)，可較好應(yīng)用于水生動物及其加工產(chǎn)品的檢測，且反應(yīng)耗時短、對設(shè)備依賴程度低，適合基層單位和現(xiàn)場檢測使用，為創(chuàng)傷弧菌的疫情監(jiān)控、污染監(jiān)測等提供了更為簡便高效的解決手段。

研究表明，gryB基因與DNA復(fù)制、限制、修飾和修復(fù)相關(guān)，在細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮重要作用，近年來常被選用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析及細(xì)菌鑒定[15-16]。本研究亦是基于gryB基因保守序列建立了RPA檢測方法，在特異性、靈敏度及應(yīng)用檢測方面上也均達(dá)到了預(yù)期效果。

RPA技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)在于在37 ℃恒溫反應(yīng)，不需要進(jìn)行復(fù)雜的反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化，本研究也只是對比測試不同反應(yīng)時長的擴(kuò)增效果，發(fā)現(xiàn)在40 min時擴(kuò)增產(chǎn)物基本可滿足檢測需求，考慮時效性及污染防控，未選用擴(kuò)增更長但可能更靈敏的反應(yīng)參數(shù)。此外，RPA技術(shù)反應(yīng)溫度接近人體溫，可不依賴PCR擴(kuò)增儀，有學(xué)者利用該特性建立了一種僅僅利用人體溫度即能完成DNA擴(kuò)增的RPA檢測方法[17]，顯著拓展了該技術(shù)的應(yīng)用條件。

靈敏度是評價檢測方法優(yōu)劣的一個關(guān)鍵參數(shù)，本研究建立的RPA技術(shù)用于檢測gryB方法，其靈敏度和普通PCR方法相當(dāng)，也與已報(bào)道的LAMP檢測方法[18-20]相當(dāng)。但RPA技術(shù)相比普通PCR，反應(yīng)更為快速（僅需30～40 min），且不依賴PCR儀;同時相比LAMP、RPA技術(shù)引物設(shè)計(jì)難度小，產(chǎn)物片段單一，便于后續(xù)進(jìn)行測序確證，具有更高的實(shí)用價值。

同PCR方法一樣，RPA技術(shù)也是擴(kuò)增檢測特定基因序列，該序列與目標(biāo)菌的性狀及行為表現(xiàn)并無必然的對應(yīng)關(guān)系，當(dāng)目標(biāo)菌數(shù)量較少、活力較弱時，使用傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)方法不一定能檢出為陽性，故在應(yīng)用檢測中可能存在假陰性問題[21]。本研究建立的RPA檢測方法，對本機(jī)構(gòu)的50例留樣的應(yīng)用檢測并未發(fā)現(xiàn)假陰性問題，可能與研究的樣本數(shù)量偏小有關(guān)。

當(dāng)然，RPA技術(shù)作為一種后起的檢測手段，也有不足之處需要完善。首先，RPA體系對于蛋白活性要求比較高，需要保證體系中的各種酶觸反應(yīng)準(zhǔn)確進(jìn)行，其技術(shù)的提升依賴現(xiàn)代酶學(xué)的發(fā)展應(yīng)用;其次，RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶，故直接電泳無法分辨出目的核酸片段，必須經(jīng)過純化去除蛋白質(zhì)[7];再次，RPA的關(guān)鍵技術(shù)有知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，試劑成本相對較高。但RPA技術(shù)作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快速便捷等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“一種可替代PCR的技術(shù)”，在病原體檢測及食品安全等眾多領(lǐng)域已經(jīng)有了越來越多的推廣應(yīng)用，技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景均較為廣闊。

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