楊樹微管功能研究植物表達載體構建及驗證

羅 瑩，張建國，劉曉霞，饒國棟＊，陸 海

(1. 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2. 中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091)

微管（Microtubule）是由 α-微管蛋白（αtubulin，TUA）和 β-微管蛋白 (β-tubulin，TUB)以異二聚體的形式聚合成的中空管狀結構，它與微絲（Microfilament）和中間纖維（Intermediate filament）共同組成了細胞骨架。微管蛋白是高度保守的，植物、動物、原生生物和真菌中的TUA和TUB蛋白具有高達88%的序列相似性[1-2]。迄今為止，人們已在擬南芥中發現6個TUA蛋白和9個TUB蛋白[3]；在水稻中發現4個TUA蛋白[4]和8個TUB蛋白[5]；在毛果楊中有8個TUA蛋白和20個TUB蛋白[6]。

微管對植物生長發育有著重要作用，研究表明，微管影響細胞形態發生，并最終影響植物的形態。Abe等[7]發現,擬南芥中 TUA6和 TUA4突變體lefty1和lefty2出現左旋生長的現象,其中,包括lefty1和lefty2雙突變體幼苗下胚軸螺旋生長，根伸長區的徑向細胞擴增，周質微管排列比野生型更加片段化且不對齊。在雙突變體植株中，花絲細胞的各向異性生長受到嚴重損害。微管和微絲骨架的動態變化還參與了細胞周期進程的調節[8]。在擬南芥中，短期的低溫會影響有絲分裂末期的徑向微管列陣的形成，從而導致二倍體和多倍體花粉的產生[9]。微管在植物抵御環境脅迫的過程中也發揮重要作用。Wang等[10]發現, 鹽脅迫誘導下擬南芥周質微管發生解聚和重組，提出周質微管在植物對鹽脅迫的耐受性中發揮重要作用。此外，微管在信息傳遞[11]、纖維素微纖維沉積和木材形成[6,12]，調節氣孔運動[13]等方面具有重要功能。

目前，林木微管蛋白功能的研究鮮有報道，特別是微管調控林木形態與材性分子機制的研究尚屬空白。研究微管功能首先要對活體材料進行微管的形態觀察，而現在缺乏林木微管研究的轉基因材料，因此，建立穩定遺傳的林木微管標記的轉基因株系是首要且重要的。為此，首先要構建植物微管熒光表達載體，且通過瞬時表達等方法加以驗證。構建熒光表達載體時，目的基因連接在熒光標簽的N’端還是C’端一直存在爭議，在擬南芥中發現，微管蛋白連接在熒光蛋白C’端時會影響轉基因植物熒光觀察[14]。本研究以84K楊為材料，克隆獲得84KTUA5和84KTUB16基因，并通過同源重組的方法分別將84KTUA5和84KTUB16基因連接至熒光標簽mCherry的N’端和C’端，共構建了4種重組載體，并通過煙草葉片瞬時表達系統，驗證了重組蛋白的表達及其產生的熒光信號，為進一步研究楊樹微管功能奠定基礎。

1 材料方法

1.1 實驗材料

本氏煙草( Nicotiana benthamiana ) 組培苗由本實驗室保存。

1.2 載體及主要試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10 感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；根癌農桿菌GV3101感受態細胞購自北京華越洋生物科技有限公司；植物表達載體pCAMBIA 1300-mCherry購自淼靈質粒平臺；EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、pTOPO-TA-simple克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；重組酶試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；試驗過程中所用的限制性內切酶均購自NEB公司；引物的合成和序列的測定均在北京擎科公司完成；卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素、利福平購自北京coolaber科技有限公司。

1.3 數據庫與分析軟件

本研究中用到的擬南芥基因組數據庫為http://www.arabidopsis.org/；毛果楊基因組數據庫為https://phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html；核酸和氨基酸序列比對軟件為BioEdit。

1.4 84K楊TUA5和TUB16基因的克隆

根據文獻中提供的毛果楊TUA5和TUB16基因編號[6]，搜索其基因組數據庫，分別獲得PtTUA5和PtTUB16基因序列。由于微管蛋白在各物種間的保守性很高，因此，本研究以毛果楊的TUA5和TUB16基因為模板，利用Primer軟件設計同源引物，用于克隆84K楊的TUA5和TUB16基因。提取84K楊的RNA并反轉錄成cDNA，以此為模板進行同源克隆，PCR克隆反應所用引物84KTUA5-UTR和84KTUA16-UTR的序列信息見表1。

表 1 84KTUA5和84KTUB16的引物Table 1 The primers of 84KTUA5 and 84KTUB16

克隆得到的84KTUA5和84KTUB16基因分別與pTOPO-T simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，并涂布于含Amp（100 mg·L-1）的LB固體培養基上，37℃倒置培養12 h，挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定并測序。測序結果利用BioEdit軟件與毛果楊的TUA5和TUB16基因進行序列比對。

1.5 植物過表達載體的構建

84KTUA5和84KTUB16與熒光蛋白基因mCheery N’端連接植物表達載體構建的具體步驟如下：雙酶切（KpnⅠ和SalⅠ）pCAMBIA 1300載體，設計與載體一致的同源重組引物（表1），PCR擴增84KTUA5和84KTUB16基因，利用重組酶clonExperss Mix將擴增得到的目的基因連接在pCAMBIA 1300載體mCherry熒光標簽的N’端，獲得植物過表達載體pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry和 pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，涂布于含Kan（50 mg·L-1）的LB固體培養基上，37℃倒置培養12 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定采用的上下游引物序列分別來自于載體和插入基因（表1），篩選陽性克隆并測序。

84KTUA5和84KTUB16與熒光蛋白基因mCheery C’端連接植物表達載體構建的具體步驟如下：由于mCherry熒光標簽的C’端存在終止密碼子且無過度序列，為了同時保證插入蛋白和熒光蛋白形成正確的構象，84KTUA5和84KTUB16基因需借助連接肽連接在mCherry熒光標簽的C’端。連接肽的序列為 (5’-GGAGGTGGAAGTGGAGGTAGCG GT-3’)，PCR 擴增 獲得 linker-84KTUA5和 linker-84KTUB16序列，引物見表1。純化回收后分別與pTOPO-T simple載體連接，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，涂布于含Amp（100 mg·L-1）的LB固體培養基上，37℃倒置培養12 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定并測序。采用同源重組的方法將上述序列與pCAMBIA 1300載體連接（酶切位點為BsrG I-HF），獲得植物過表達載體pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，涂布于含Kan（50 mg·L-1）的LB固體培養基上，37℃倒置培養12 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，引物見表1，篩選陽性克隆并測序。載體構建過程見圖1。

圖 1 植物表達載體的構建過程Fig. 1 Construction process of plant expression vector

1.6 農桿菌轉化

構建成功的重組質粒通過電擊轉化法轉入農桿菌GV3101中，涂布在含有Rif（50 mg·L-1）、Kan（50 mg·L-1）和 Gent（50 mg·L-1）的 LB 固體培養基上，28℃倒置培養24 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定并測序。

1.7 煙草瞬時表達和熒光觀察

含有重組質粒的農桿菌菌液擴大培養至OD600=0.6～0.8，5 000 rpm離心10 min，收集菌體，配制煙草注射液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，pH 5.6），加入 200 μmol·L-1AS（乙酰丁香酮），懸浮菌體，使OD600約為1.0，室溫放置2 h，選取3～4周長勢較好的本氏煙草為植物材料，按照Imogen等[15]的瞬時表達方法，用注射器將注射液從葉片下表皮注射到煙草葉片內（圖2A）。

農桿菌侵染48 h后的本氏煙草葉片置于滴有蒸餾水的載玻片上，做成臨時封片，立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片組織的上表皮細胞。本研究中所用的顯微鏡為Zeiss LSM510倒置激光掃描共聚焦顯微鏡。所用激光器為594 nm氦氖激光器（2 mW），激發光波長為594 nm，發射光接收范圍為630～695 nm。用于圖像采集的顯微鏡物鏡為40×物鏡，數值孔徑為1.44，針孔大小為1 AiryUnit，掃描分辨率為1 024×1 024。采用Zen軟件分析實驗結果。

2 結果與分析

2.1 84K楊TUA5和TUB16基因的獲得

從克隆產物菌落PCR鑒定結果（圖3）可以看出：在1 300 bp左右有明顯條帶，與預測的目的基因片段大小吻合，初步確定為目的基因片段。測序結果顯示：84KTUA5基因CDS序列全長1 344 bp，編碼448個氨基酸；84KTUB16基因CDS序列全長1 356 bp，編碼452個氨基酸，利用BioEdit軟件對84K楊與毛果楊中的TUA5和TUB16基因序列進行同源比對（表2），其同源性分別達98.80%和96.70%。

圖 2 PCR鑒定結果Fig. 2 PCR identification results

表 2 序列同源性比對Table 2 Sequences homology alignment %

2.2 重組表達載體的鑒定

對4種重組表達載體pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry、 pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry、pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5、pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16進行菌落PCR鑒定。由圖4可以看出：2 200 bp左右有明顯條帶，與預測序列大小一致。經測序后，用BioEdit軟件進行序列分析，結果表明，目的基因已成功插入pCAMBIA 1300-mCherry表達載體中。

2.3 煙草瞬時表達結果

激光共聚焦結果（圖2B）顯示：pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16重組質粒轉化的煙草葉片上表皮細胞的細胞膜上有紅色熒光分布，表明這兩種融合蛋白能夠正確表達，可以用于后續的遺傳轉化實驗；而pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry和pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry重組質粒轉化的煙草葉片上表皮細胞無法觀察到紅色熒光，說明這兩種融合蛋白未能正確表達，無法用于后續實驗。本實驗觀察的是葉片上表皮細胞，幾乎不含葉綠體，因此，葉綠體自發熒光對觀察結果的影響較小，且由于熒光標記的是周質微管，因而，只在細胞邊緣發現紅色熒光。

圖 3 重組表達載體PCR鑒定Fig. 3 PCR identification of recombinant expression vectors

圖 4 煙草瞬時表達結果Fig. 4 Transient expression in tobacco

3 討論

林木遺傳改良的兩個重要方向：林木材性的遺傳改良和林木形態的遺傳改良。現階段，針對林木材性遺傳改良的研究主要集中在木質素及纖維素合成與調控的分子機理上[16]，直接研究木質素和纖維素合成與調控的相關通路及結構基因已成為當今的熱點。微管作為纖維素合酶的軌道，指導了纖維素的合成與延伸[12,17]。因此，研究林木微管的結構與功能，解析微管間接調控林木材性的分子機理對林木遺傳改良同樣具有十分重要的意義。林木形態的改良還主要集中在傳統的選育水平，從分子水平解析林木形態決定的關鍵因子顯得尤為重要。微管通過不同的排列方式決定了細胞的形態，最終導致了植株的形態差異，研究微管的結構與功能對林木的形態改良同樣具有十分重要的意義。為了彌補研究林木微管功能所需活體材料的空缺，建立穩定遺傳的林木微管標記的植物材料十分必要。本研究旨在構建林木微管功能研究植物表達載體，并讓其在植物中表達，為建立微管功能研究林木轉基因材料奠定基礎。

高度保守的微管蛋白在物種間具有很高的序列相似性，毛果楊中有8個TUA蛋白和20個TUB蛋白，本研究選取了本底表達量較高的PtTUA5和PtTUB16基因作為模板設計引物，同源克隆得到84K楊的84KTUA5和84KTUB16基因，分析結果顯 示:84KTUA5和 PtTUA5同 源 性 為 98.80%，84KTUB16 和PtTUB16同源性為96.70%，將二者分別與pCAMBIA 1300載體mCherry熒光標簽的N’端和C’端進行同源重組，構建植物過表達載體。

pCAMBIA 1300系列載體為雙元表達載體，是目前比較主流并得到廣泛認可的植物表達載體。相比于卡那霉素或草銨膦等抗性基因，pCAMBIA 1300載體在植物中具有的潮霉素抗性更易篩選獲得陽性植株。本研究中選用的mCherry為紅色熒光蛋白，為將來以其他顏色熒光（如GFP/YFP熒光蛋白）研究微管功能提供背景材料。

構建的4種重組質粒中，目的基因連接在mCherry熒光標簽N’端的融合蛋白未能在煙草中成功表達，推測原因是融合蛋白沒有正確折疊形成有生物學功能的蛋白質。直接將兩種蛋白融合時常會導致嵌合的蛋白形成空間位阻，影響蛋白活性，連接肽的引入對融合蛋白的表達、活性和穩定性有重要作用。連接肽有柔性和剛性之分，柔性連接肽主要由 Gly和 Ser組成，如 Huston等[18]提出的（GGGGS）n（n≤6）序列，剛性連接肽是α螺旋結構的，一般使用的是（EAAAK）n（n≤6）。連接肽的長度影響融合蛋白的活性和穩定性。本研究中設計了8個氨基酸長度的柔性連接肽（GGGSGGSG），用于目的基因與mCherry基因的C’端連接，使融合蛋白成功表達。

4 結論

本研究分別構建了84K楊TUA5和TUB16基因與pCAMBIA 1300-mCherry的4種融合表達載體，并通過農桿菌介導的煙草瞬時表達證實：目的基因通過連接肽連接在pCAMBIA1300載體mCherry熒光標簽C’端的融合表達載體pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和 pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16能夠在植株中正確表達，且能產生較強的紅色熒光信號。楊樹微管功能研究植物表達載體的構建及驗證，為研究微管調控林木形態與材性奠定了基礎。筆者將利用以上2種融合表達載體進行楊樹的遺傳轉化，進一步研究楊樹各個組織微管形態的差異。