K-RAS蛋白表達及基因狀態在胃癌組織中的臨床意義

宗桂娟，尹海兵，李春筍，陳旭東，蔡南南，楊磊，趙斌，何松

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率逐年上升，嚴重危害人類健康［1］。多數胃癌病人即使采用圍手術期化療及輔助化療，生存率仍較低。因此尋找新的治療途徑如分子靶向治療成為胃癌研究的熱點［2-3］。K-RAS基因編碼的p21-ras蛋白位于細胞質膜上轉導細胞生長與分化的信號［4］。K-RAS突變主要發生在12、13和61編碼子上，這些突變可造成K-RAS基因激活［5-7］。結直腸癌病人存在40%～45%K-RAS基因突變，可導致細胞持續生長，抑制細胞凋亡［6］。目前K-RAS基因在結直腸癌方面的研究較多，但在胃癌中的研究卻鮮有報道［7］。本研究采用免疫組化法、PCR法檢測胃癌中K-RAS蛋白表達和基因狀態，將胃癌組織中KRAS蛋白表達、基因狀態與病人臨床參數進行分析。并探討K-RAS基因突變與蛋白表達水平是否存在一致性，旨在為胃癌靶向治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 314例胃癌組織樣本來自南通市腫瘤醫院。選取自2016年1月至2017年12月胃癌病人手術切除的標本。納入標準：無合并其他惡性腫瘤或者胃癌復發后再次手術者，臨床病理資料完整，術前未行放化療及其他抗腫瘤治療，手術病理診斷明確為胃癌。男233例，女81例。年齡范圍為32～88歲，中位年齡65歲。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 實驗試劑 免疫組織化學法（免疫組化）所用抗體即用型試劑盒和一抗均購自Proteintech公司；人組織基因組核酸提取試劑盒（貨號為DE02003）及核酸提取儀均來自上海科亦生物科技有限公司。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision（二步法）完成。K-RAS一抗工作濃度為1∶500，抗原修復方式為熱修復（Trish EDTA pH9.0）97℃，30 min。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。結果判定：PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性的肝癌組織切片為陽性對照。Fromowitz綜合計分法將細胞著色強度與陽性細胞所占百分比二者綜合判定，陽性細胞百分數為10個視野陽性細胞平均數占其細胞總數的百分比：＜5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；＞75%計4分。細胞著色強度：不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。二者積分相加：0～1分為陰性，≥2分為陽性［8］。

1.4 熒光定量PCR 基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行；本實驗所用引物為，正向5′-ATT TTT ATT ATA AGG CCT GCT G-3′和反向5′-CAA AGA ATGGTCCTGCACCAG-3′；20μLPCR反應體系包括10 μL的2×Expfu Mix、15 pmol的正向引物、15 pmol的反向引物和3μL的樣品，加入PCR水體系補足至20μL；PCR程序如下：95℃預變性5 min，接著進行35個擴增循環：95℃10 s，58℃35 s，72℃15 s，隨后72℃5 min延伸。PCR產物測序由上海科亦生物有限公司完成。

1.5 統計學方法 應用SPSS15.0軟件進行數據處理及統計學分析，計數資料以例（%）表示，結果比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 K-RAS蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系 根據病人的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移、有無脈管侵犯等病理參數，將314例病人標本進行分組。通過統計學分析，結果顯示K-RAS蛋白表達陽性率為13.05%，其表達與病人性別（P＝0.585 8）、年齡（P＝0.648 5）、腫瘤大小（P＝0.761 1）、脈管侵犯（P＝0.552 4）、有淋巴結轉移差異無統計學意義（P＝0.506 4）；與組織學分化程度差異有統計學意義（P＝0.019 5）。各組K-RAS蛋白表達情況見表1。

表1 K-RAS蛋白表達與胃癌臨床特征的關系/例

2.2 分析不同年齡、性別、組織學分級胃癌病人基因K-RAS突變情況 通過分析發現314例胃癌組織K-RAS基因狀態，其中K-RAS基因突變8例，突變率為2.54%，且K-RAS基因突變頻率在不同性別（P＝0.456 6）、年齡（P＝0.524 2）及組織學分級（P＝0.747 4）胃癌病人中差異無統計學意義。各組K-RAS基因突變頻率見表2。

表2 胃癌病人中不同年齡、性別、組織學分級群體中K-RAS基因的突變頻率/例（%）

2.3 K-RAS基因突變與蛋白表達的關系 PCR法檢測胃癌組織中K-RAS基因狀態，結果顯示K-RAS突變8例（突變率為2.54%），突變類型包括G12D（3例）、G13D（2例）、G12A（1例）、G12S（1例）、G13S（1例）；此外，基因突變病人中3例免疫組化檢測結果為陽性，即免疫組化結果與基因突變率結果相同者3例。K-RAS基因突變率與蛋白表達的檢出率不同（P＝0.037 7），故兩者關聯性低。見表3。

表3 K-RAS基因突變及K-RAS蛋白表達分布/例（%）

3 討論

RAS基因家族包括H-RAS、K-RAS、N-RAS基因，分別編碼H-RAS、K-RAS、N-RAS蛋白，它們具有相似的結構和功能［9］。RAS蛋白位于細胞膜內側，將EGFR的信號轉導給MAPKs，進而調控細胞的生長、增殖及血管生成［10-11］。一般情況下K-RAS基因處于相對靜止狀態，當受到持續刺激作用與政策細胞激活K-RAS，導致細胞惡性生長，促進腫瘤發生發展［12-13］。因此研究K-RAS在胃癌發生發展中的作用具有重要的臨床意義。

本研究結果顯示胃癌K-RAS蛋白表達與病人性別、年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、有無淋巴結轉移無明顯關系（P＞0.05）；但K-RAS蛋白表達與分化程度密切相關（P＜0.05），提示K-RAS可能參與了胃癌的發展進程。Kikuchi等應用免疫組化法研究K-RAS在80例胃癌表達情況，結果發現隨著胃癌分化程度的增加則表達升高，與本研究結果一致［14］。

K-RAS基因突變率在不同腫瘤中明顯不同。文獻報道胰外分泌腺癌基因突變率高達90%，結腸癌為40%～50%，肺癌和膀胱癌為40%，而胃癌在10%以下［15］。本實驗檢測314例胃癌組織K-RAS基因狀態，其中K-RAS基因突變8例，突變率為2.54%。K-RAS基因突變結果與國外研究一致。KRAS基因在不同性別、年齡、組織分化之間的突變率無顯著差異。K-RAS突變與病人缺乏對EGFR單抗的反應有關，突變者不適用西妥昔單抗治療［16］。2010年NCCN臨床指南中推薦：結直腸癌病人在接受西妥昔單抗治療前，進行K-RAS基因突變檢測，確定是否接受該靶向治療［17-18］。另外本研究中KRAS蛋白的陽性率為13.05%，其蛋白陽性率遠高于基因突變率。因此K-RAS的免疫組化結果不能替代基因突變檢測結果，對于考慮選用西妥昔單抗治療的病人，可以采用熒光定量PCR法檢測EGFR及K-RAS基因狀態。

綜上，K-RAS在胃癌中的蛋白表達可能作為判斷胃癌惡性程度的分子生物學標志物。K-RAS基因的突變狀態和靶向EGFR單克隆抗體的治療效果相關，因此胃癌病人可通過K-RAS基因檢測結果采用個體化治療。