miR-133a對急性心肌梗死的早期診斷及預后評估價值

唐冬娟，薛曉梅，何 斌

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院麻醉與重癥醫(yī)學科，上海 200092

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[冠心病（coronary artery heart disease，CHD） ]中較為嚴重的疾病之一。在過去的幾十年里，AMI的發(fā)病率和死亡率呈顯著上升趨勢且日益年輕化[1-2]。研究[3]顯示，早期診斷和治療可顯著降低AMI的死亡率，改善患者的遠期預后。臨床上常采用心肌損傷標志物肌鈣蛋白（troponin I，cTnI）對AMI患者進行診斷，但近年來cTnI的靈敏度和特異度備受質(zhì)疑。相關(guān)研究[4]顯示，cTnI需在胸痛發(fā)作4～12 h才能在血清中被檢測到。即使是靈敏度和特異度均較高的高敏肌鈣蛋白，對其進行檢測也需在胸痛發(fā)作3 h之后[5]。另有研究[6-7]顯示，cTnI在嚴重心力衰竭、心房顫動等心臟疾病以及慢性腎病、嚴重膿毒癥和感染性休克等非心臟疾病中的表達量均有所增加。因此，尋找靈敏度和特異度更高的新型生物標志物實現(xiàn)對AMI的早期診斷，已成為臨床工作中亟需解決的問題。

多項研究[8-9]證實，miRNA與CHD的生理、病理發(fā)展有關(guān)，且在血漿或其他體液中具有良好的穩(wěn)定性[10]，便于檢測。部分研究[11-13]表明，某些miRNA具有心肌細胞特異性，如miR-1、miR-133a、miR-208、miR-499等，有望成為心血管疾病的新型生物標志物。已有研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，在AMI早期（6 h內(nèi)）多種miRNA出現(xiàn)高水平表達，如miR-133a，故被認為可能是AMI早期診斷的生物標志物。某些miRNA與冠狀動脈狹窄的嚴重程度有關(guān)[17]，即循環(huán)中的miRNA表達水平越高則血管狹窄程度越嚴重，且血液循環(huán)中miRNA水平可能影響AMI患者的死亡率及1年生存率[18]。但鮮有同時針對心肌細胞特異性miR-133a在AMI的早期診斷、冠狀動脈狹窄程度及預后中的潛在應用價值的評估。

基于此，本研究通過檢測緊急胸痛患者血清中miR-133a的表達水平，對其作為診斷AMI的生物標志物的潛力以及與冠狀動脈狹窄程度、30 d內(nèi)心血管不良事件發(fā)生率的相關(guān)性進行評估，以期為AMI的早期診斷和預后評估提供更多的臨床證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及資料收集

本研究納入2018年7月—2019年5月于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院因胸痛緊急（6 h內(nèi)）就診的90例患者。根據(jù)《2015急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》和《2015 ESC NSTE-ACS指南》，患者被分為AMI組（63例）、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP ）組（13例）和對照組（包括主動脈夾層、心力衰竭、穩(wěn)定型冠心病、反流性食管炎、低鉀等，共14例）。入組標準：①胸痛。②年齡＞18歲。排除標準：①近期已接受過緊急冠狀動脈溶栓、支架植入或搭橋手術(shù)。②處于妊娠期和哺乳期。③患有精神障礙。④正在使用其他試驗性藥物。

本臨床試驗的實施遵循《赫爾辛基宣言》、中國相關(guān)法律法規(guī)和臨床試驗機構(gòu)倫理委員會的意見，已獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：XHEC-C-2016-023-2），并通過了clinicaltrial.gov審核（注冊號：NCT02755207）。所有患者均已簽署知情同意書。

記錄入院時所有患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、冠心病史、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史；并采用袖帶法測量患者入院即刻血壓，記錄收縮壓及舒張壓。所有胸痛患者行超聲心動圖檢查，記錄左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。隨訪所有患者，統(tǒng)計其在確診30 d內(nèi)的心血管不良事件的發(fā)生情況，包括再發(fā)心肌梗死、心絞痛、心力衰竭及心源性死亡等。

1.2 實驗室指標測定

采用電化學發(fā)光儀（Beckman Coulter，美國，Access2）檢測所有患者入院即刻的cTnI、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）和肌紅蛋白（myoglobin，Mb）水平。采用電化學發(fā)光儀（Roche，瑞士，Cobas E411）檢測N末端B型腦鈉肽前體（N-terminal B-type natriuretic，NT-proBNP）水平。采用全自動生化免疫分析儀（Johnson& Johnson，美國，VITROS 5600）測定總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TAG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-Ch）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-Ch）及肌酐（creatinine，Cre）的水平。

1.3 冠狀動脈造影檢查

對AMI組和UAP組患者行冠狀動脈造影檢查。該檢查均由經(jīng)驗豐富的心血管介入醫(yī)師完成，并按照常規(guī)投射體位行左右冠狀動脈造影。Gensini評分是用于評估冠狀動脈病變嚴重程度的評分系統(tǒng)[19]。規(guī)則如下：管腔狹窄1%～25%計1分，管腔狹窄26%～50%計2分，管腔狹窄51%～75%計4分，管腔狹窄76%～90%計8分，管腔狹窄91%～99%計16分，完全狹窄計32分。

1.4 樣本收集及血清miR-133a檢測

所有胸痛患者入院后立即采集血樣至非抗凝管中，于4 ℃ 1 499×g離心10 min獲得血清，并將其轉(zhuǎn)至無RNA酶的1.5 mL離心管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩６螅瑸槊鞔_AMI患者經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）術(shù)后miR-133a水平變化，抽取14例AMI患者PCI術(shù)后24 h血清樣本并于-80 ℃保存，用于后續(xù)檢測。

應用實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR）儀（ABI，美國，7500）自帶分析軟件檢測血清中miR-133a水平。該qPCR為加尾法，以U6 為內(nèi)參，用miRNeasy血清血漿純化試劑盒（Qiagen，德國，應用生物系統(tǒng)）進行小RNA提取，用Mir-X?miRNA First Strand Synthesis Kit miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，再用Mir-XTMmiRNA qRT-PCR TB GreenTMKit試劑盒（TaKaRa，日本）進行qPCR，所有操作均嚴格按照說明書進行。設置3個復孔，記錄每孔的CT值，以3個復孔的平均值作為最終結(jié)果。采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.5 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 7和SPSS 23.0對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定性資料以頻數(shù)和百分率表示，采用獨立樣本χ2檢驗及t檢驗。符合正態(tài)分布的定量資料以x—±s表示，不符合正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示。采用單因素方差分析、Spearman相關(guān)性對3組間進行比較。采用多因素Logistic回歸模型對AMI的危險因素進行分析。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）下面積（area under the curve，AUC）分析miR-133a對AMI的早期診斷價值及30 d內(nèi)心血管不良事件發(fā)生率的評估價值。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

本研究共納入90例胸痛患者，根據(jù)AMI的診斷指南分為AMI組、UAP組和對照組。采用χ2檢驗及t檢驗對患者的臨床資料（包括分類數(shù)據(jù)、連續(xù)性數(shù)據(jù)）進行比較分析，結(jié)果顯示3組患者的年齡、性別、糖尿病史、吸煙史、高血壓病史、入院即刻血壓、LVEF及30 d內(nèi)不良心血管事件發(fā)生率間差異均無統(tǒng)計學意義，而僅冠心病史的組間差異顯著（P=0.003）；實驗室指標的檢測結(jié)果顯示，3組患者的cTnI、Mb、CK-MB及TAG間差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；同時，AMI組和UAP組患者的Genisi評分間差異亦具有統(tǒng)計學意義（P=0.010）。具體數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 3組患者的臨床資料比較Tab 2 Comparison of clinical data among the three groups

Continued Tab

2.2 3組患者血清miR-133a的表達水平及與心肌損傷指標的相關(guān)性分析

采用qPCR檢測入組患者即刻血清中miR-133a的表達，結(jié)果（圖1A）顯示AMI組患者血清中miR-133a的相對表達水平（5.85±2.43）高于UAP組（4.68±1.44）和對照組（0.95±0.38），且差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.046，P=0.000）。隨后，針對14例AMI患者PCI術(shù)后24 h血清miR-133a的表達進行分析，結(jié)果顯示與術(shù)前相比，術(shù)后miRNA-133a的表達水平較低（5.02±1.89vs2.70±1.16，P=0.001）。

圖1 miR-133a表達水平及其與心肌損傷指標的相關(guān)性分析Fig 1 Expression level of miR-133a and its correlation with myocardial injury indexes

考慮到患者cTnI、Mb、CK-MB臨床實測值間差異較大且不符合正態(tài)分布，而對該數(shù)據(jù)進行l(wèi)n轉(zhuǎn)化后則均服從正態(tài)分布，因此采用Spearman相關(guān)性分析對轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果（圖1B～D）顯示：miR-133a 的表達與 cTnI（r=0.155，P=0.000）、Mb（r=0.658，P=0.001）及CK-MB（r=0.090，P=0.004）均呈正相關(guān)。

2.3 miR-133a對AMI的早期診斷價值

應用ROC曲線分析比較miR-133a和臨床常用心肌損傷標志物cTnI對AMI的早期診斷價值，結(jié)果顯示miR-133a的 AUC 為 0.816（95%CI0.716～ 0.917），cTnI的AUC為0.796（95%CI0.691～0.901），具有統(tǒng)計學意義（P=0.000，圖 2）。

2.4 miR-133a與Gensini評分的相關(guān)性分析

記錄行冠脈造影檢查患者的Gensini評分，并采用Spearman相關(guān)分析對miR-133a與冠狀動脈狹窄程度間的相關(guān)性進行評估，結(jié)果（圖3）顯示患者血清miR-133a的表達水平與Gensini評分均呈正相關(guān)（r=0.263，P=0.001）。

圖2 miR-133a對AMI診斷的ROC曲線Fig 2 ROC curve of miR-133a for AMI diagnosis

2.5 多因素Logisitic回歸模型分析AMI的危險因素

圖3 miR-133a的表達水平與Gensini評分的相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis between expression level of miR-133a and Gensini score

以是否發(fā)生AMI為因變量，以患者臨床資料分析中有統(tǒng)計學意義的因素為自變量，采用多因素 Logistic 回歸模型對AMI的危險因素進行分析，結(jié)果顯示miR-133a和冠心病史是AMI發(fā)生的獨立危險因素（均P＜0.05，表 3）。

表3 AMI危險因素的多因素Logisitic回歸分析Tab 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors in the incidence of AMI

2.6 miR-133a和cTnI對AMI患者30 d內(nèi)不良事件發(fā)生率的評估價值

通過隨訪患者30 d，對其心血管不良事件的發(fā)生情況進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示AMI組發(fā)生心源性死亡2例、再次心肌梗死1例、心絞痛2例、心力衰竭1例，UAP組發(fā)生心絞痛3例，對照組發(fā)生心力衰竭1例。采用ROC曲線分析miR-133a與cTnI對AMI患者30 d內(nèi)心血管不良事件的預測價值，結(jié)果（圖4）顯示miR-133a的AUC為 0.700（95%CI0.535～ 0.865），cTnI的 AUC 為 0.544（95%CI0.387～0.701）。隨后對ROC曲線做進一步分析，結(jié)果（表4）顯示miR-133a的靈敏度和特異度較高。

圖4 miR-133a與cTnI對AMI患者30 d內(nèi)心血管不良事件預測價值的ROC曲線Fig 4 ROC curve of the predictive value of miR-133a and cTnI for 30-day cardiovascular adverse events in patients with AMI

表4 miR-133a和cTnI對AMI患者30 d內(nèi)心血管不良事件發(fā)生率的比較分析Tab 4 Comparative analysis of miR-133a and cTnI on the incidence of 30-day cardiovascular adverse events in AMI patients

3 討論

臨床上，AMI病情變化快、死亡率高，是常見的心血管急重癥之一。因此，對該疾病的早期精準診療是預防患者死亡及其他心血管不良事件發(fā)生的重要手段。傳統(tǒng)觀念認為cTnI是AMI早期診斷的經(jīng)典生物標志物，而近期研究則證實cTnI在診斷AMI的特異度和靈敏度均有所下降[5-6]。miRNA是一類內(nèi)源性的短RNA片段，不編碼蛋白質(zhì)。相關(guān)研究[20-23]顯示，其參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心力衰竭等。此外，miRNA具有良好的組織特異性和穩(wěn)定性[24]。近期的多項研究[25-26]證實，miRNA可作為AMI早期診斷的生物標志物。Gacoń等[16]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者病變血管閉塞與未閉塞相比，其miR-133a的表達可升高7倍，但cTnI的表達無差異。因此，尋求特異度和靈敏度更高的AMI早期診斷的生物標志物是十分必要的。

本研究中，我們以緊急胸痛就診的患者為研究對象，通過檢測胸痛患者血清中miR-133a的表達水平，分析miR-133a與冠狀動脈病變嚴重程度的關(guān)系，并進一步闡明miR-133a作為AMI早期診斷標志物的潛在應用價值。結(jié)果顯示，AMI組患者血清中miR-133a的水平顯著高于UAP組和對照組；Spearman相關(guān)性分析提示，miR-133a的表達水平與cTnI、CK-MB、Mb水平均呈正相關(guān)；ROC曲線分析顯示，與cTnI相比，miR-133a對AMI具有較好的診斷價值；同時經(jīng)多因素Logisitic回歸模型分析提示，miR-133a是AMI發(fā)生的獨立危險因素。上述結(jié)果均提示，miR-133a可能是AMI早期診斷的潛在新型生物標志物。

一個理想的生物標志物不僅應具有較高的敏感度和特異度，還應當能夠?qū)Σ∽儑乐爻潭冗M行衡量[27]。本研究通過測量患者血清miR-133a水平，分析其與冠狀動脈狹窄程度的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述兩者呈正相關(guān)，從而進一步證明miR-133a來自心肌細胞；繼而推測，miR-133a可能被證明是預測心肌缺血風險的標志物，或可作為預防和早期AMI干預的指標之一。本研究針對部分AMI患者PCI術(shù)后24 h血清miR-133a相對表達量檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后的表達水平較術(shù)前顯著降低；繼而說明，PCI與梗死相關(guān)動脈的通暢率、閉塞冠狀動脈再灌注相關(guān)，及時行PCI可預防心肌壞死。該結(jié)果與Araszkiewicz等[28]報道相一致。

隨后，本研究通過隨訪追蹤患者30 d內(nèi)心血管不良事件的發(fā)生率，并行ROC曲線分析顯示，miR-133a的AUC為 0.700（95%CI0.535～ 0.865），cTnI的 AUC為0.544（95%CI0.387～0.701）；經(jīng)進一步分析發(fā)現(xiàn)，當miR-133a的截斷值為5.80時，其敏感度為80%、特異度為67.9%，均略優(yōu)于cTnI。由此可見，miR-133a對AMI患者30 d內(nèi)發(fā)生心血管不良事件具有較好的預測價值。然而，由于本研究納入的病例樣本量較少、進行隨訪的時間較短，可能導致miR-133a對AMI患者的預后評估價值存在一定的差異；因此，后續(xù)需要進一步加大樣本量并延長隨訪時間，對該研究結(jié)果作進一步驗證。

綜上所述，miR-133a的診斷效能較好，可作為早期診斷AMI的潛在生物標志物，且miR-133a可能與冠狀動脈病變的嚴重程度及預后有關(guān)，有望作為預測AMI患者30 d內(nèi)心血管不良事件發(fā)生率的指標之一，值得進一步探索。