中國漢族人群GAD1和GABRB3基因啟動子區單核苷酸多態性與精神分裂癥的關聯研究

李 娜，安 宇，張永錄，丁志杰，吳柏林，蘭小平

1. 隴東學院生命科學與技術學院，慶陽 745000；2. 復旦大學人類表型組研究院，上海 201203；3. 甘肅省天水市第三人民醫院精神科，天水741000；4. 復旦大學生物醫學研究院，上海200032；5. 天水師范學院生物工程與技術學院，天水741000；6. 上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海200040

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一類病因未明的精神類疾病，以妄想、幻想及認知障礙為典型特征，終身患病率為1%[1]，遺傳度高達79%[2]。目前認為SZ具有高度遺傳異質性，不同性別SZ患者的發病年齡和SZ亞型不同[3-4]。

隨著分子遺傳學技術的發展，已有大量研究發現γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）與 SZ的發病具有相關性。GABA是中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，由腦內興奮性神經遞質谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（glutamicacid decarboxylase，GAD）的催化下生成。研究[5-7]發現SZ患者死亡后腦組織中GABA活性水平及谷氨酸脫羧酶 67（glutamate decarboxylase 67，GAD67）亞型的mRNA的表達量下降。GAD67由位于2q31.1區的谷氨酸脫羧酶1（glutamate decarboxylase 1，GAD1）基因編碼，該基因包含17個外顯子。除了合成GABA的限速酶GAD1基因表達量改變引起GABA活性水平下降外，GABA受體也參與SZ的發病。γ-氨基丁酸A受體β3亞基 [γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor β-3，GABRB3]基因、γ-氨基丁酸 A 受體 α5亞基 [γ-aminobutyric acid（GABA）Areceptor α-5，GABRA5] 基因和 γ-氨基丁酸 A受體γ3亞基[γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor γ-3，GABRG3] 基因構成 γ-氨基丁酸 A 受體 [γ-aminobutyric acid （GABA）Areceptor，GABAA]的基因簇，分別編碼 GABAA受體的 β3、α5和 γ3亞基。已有研究[8-10]表明GABRB3基因是SZ的易感基因。然而，以往的研究所選的相關基因的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點大多數來自于基因編碼區，主要關注因氨基酸序列改變導致蛋白質功能異常對SZ的影響，很少對基因非編碼區SNPs位點進行研究。本文選取GAD1和GABRB3基因啟動子區SNPs位點為研究對象，對中國漢族人群中GAD1基因rs3791878、rs3749034位點和GABRB3基因rs4906902位點的多態性與SZ的相關性進行分析。統計手冊》（第 4 版）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-Ⅳ）診斷標準明確診斷，且樣本間不存在親緣關系。624例正常個體樣本（對照組）來自天水市健康志愿獻血者，其中男性350名，女性274名，平均年齡（52.22±19.24）歲，所有正常個體均由2名以上精神科副主任醫師確認無精神類疾病和陽性家族史，樣本間不存在親緣關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究所有對象均來源于中國漢族人群，545例SZ患者樣本（病例組）來自2012年10月至2013年10月在天水市第三人民醫院就診的患者，其中男性310例，女性235例，平均年齡（37.35±12.82）歲。所有SZ患者均由2名以上精神科副主任醫師參照《美國精神障礙診斷與

1.2 研究方法

1.2.1 基因選擇、啟動子區預測及Tag-SNPs的選擇 根據已有文獻報道[11-12]和蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）在線數據庫STRING （http://string-db.org/）的分析結果，選擇了在GABA通路中存在互作關系的GAD1和GABRB3基因作為目標基因。通過序列保守性分析預測了GAD1和GABRB3基因的啟動子區域，結合1000 GENOMES數據庫中的中國北京漢族人群（Han Chinese in Beijing，CHB）和中國南方漢族人群（Southern Han Chinese，CHS）（CHB+CHS=197）的 SNPs數據（dbSNP137），利用Haploview 4.2軟件，以條件決定系數r2＞0.8、最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF） ＞0.05為標準進行選擇，共篩選出 3個標簽SNPs（Tag-SNPs），分別是位于GAD1基因啟動子區的rs3791878和rs3749034位點及位于GABRB3基因啟動子區的rs4906902位點。

1.2.2 樣本采集及基因組DNA提取 本研究經天水市第三人民醫院倫理委員會批準。受試者均由本人或監護人簽署知情同意書后，采集EDTA抗凝外周靜脈血3～5 mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，德國）試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 SNaPshot基因分型 采用SNaPshot分型技術檢測Tag-SNPs的多態性。在T100TMPCR 儀（Bio-Rad，美國）上 利 用 Qiagen multiplex PCR kit（100）（QIAGEN， 德國）試劑構建多重PCR反應體系，50 μL PCR反應物 包含 0.2 μmol/L PCR 引物（表 1）和 1 μL 模板 DNA，PCR反應條件為：97 ℃ 5 min，35個循環，95 ℃ 30 s，58 ℃90 s，72 ℃ 60 s，72℃ 10 min。經純化和 SNaPshot單堿基延伸反應后，利用ABI 3130 DNA 測序儀（Applied Biosystems，美國）檢測等位基因分布。SNaPshot試劑盒為 SNaPshot master mix（Applied Biosystems，美國）。應用Soft Genetics Gene Marker v 2.2.0 軟件進行基因型分析。隨機抽取 10%的樣本使用 ABI 3130 DNA 測序儀進行雙向Sanger測序驗證，基因分型一致率為100%。

表1 SNaPshot分型引物Tab 1 Primers for SNaPshot genotyping

1.3 統計學分析

使用 R64 3.5.3 軟件分析病例組與對照組間年齡和性別的差異，年齡分析采用兩獨立樣本t檢驗、性別分析采用χ2檢驗。應用SNPstats（https://www.snpstats.net/snpstats/start.htm）在線軟件進行哈迪 - 溫伯格平衡 （Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE） 檢驗、等位基因和不同遺傳模式下基因型分布分析。采用Kaplan-Meier統計分析檢驗rs3791878位點風險基因型G/T與男性SZ患者發病年齡的相關性。樣本量統計效能檢驗使用Quanto 1.2.4軟件計算。所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般人口學資料

病例組共545例，男性310例（56.9%），女性235例（43.1%），年齡14～76歲，平均年齡（37.35±12.82）歲。對照組共624例，男性350例（56.1%），女性274例（43.9%），年齡19～88歲，平均年齡（52.22±19.24）歲。病例組與對照組相比，性別構成差異無統計學意義（P=0.831），年齡差異有統計學意義（P=0.000）。

2.2 統計效能檢驗

Tag-SNPs中rs3749034 的MAF最小（MAF=0.233）。假設OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率為1%[1]，根據Quanto1.2.4軟件計算，結果顯示統計效能為0.99。

2.3 Tag-SNPs等位基因分布比較

對照組中3個Tag-SNPs位點基因型分布符合HWE檢驗。由于樣本損失，有18例樣本的rs3791878位點數據缺失，12例樣本的rs3749034位點數據缺失，3例樣本的rs4906902位點數據缺失。分別在總體樣本和性別分層后樣本的病例組與對照組之間對3個Tag-SNPs位點的等位基因分布進行分析。結果顯示：總體樣本病例組與對照組相比，3個Tag-SNPs位點等位基因分布差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）；男性病例組與對照組相比，rs3791878位點等位基因分布差異有統計學意義（P=0.039），P值經 Bonferroni校正后，差異無統計學意義（P=0.117）；女性病例組與對照組相比，3個Tag-SNPs位點等位基因分布差異均無統計學意義（P＞0.05）（表 3）。

表2 病例組與對照組Tag-SNPs 等位基因分布的比較Tab 2 Comparison of allele distribution of Tag-SNPs between case group and control group

表3 病例組與對照組Tag-SNPs等位基因分布的比較（按性別分層）Tab 3 Comparison of allele distribution of Tag-SNPs between case group and control group （stratified by sex）

2.4 Tag-SNPs基因型分布比較

分別在共顯性（co-dominant）、顯性（dominant）、隱性（recessive）、超顯性（over-dominant）和加性化（logadditive）5種不同的遺傳模式下對3個Tag-SNPs位點基因型分布進行分析。結果顯示，總體樣本的病例組與對照組相比，rs3791878位點在共顯性、顯性和超顯性遺傳模式下基因型分布差異均有統計學意義（P=0.022，P=0.011，P=0.006）。挑選赤池信息準則（Akaike Information Criterion，AIC）和貝葉斯信息準則（Bayesian Information Criterion，BIC）數值最小的超顯性遺傳模式為rs3791878位點可能的遺傳模型，該模型下的P值經Bonferroni 校正后，差異仍有統計學意義（P=0.018）。而rs3749034位點和rs4906902位點在5種不同遺傳模式下基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05）（表4）。在性別分層后樣本的病例組與對照組之間對rs3791878位點的基因型分布進行分析，結果顯示：男性病例組與對照組相比，rs3791878位點在超顯性遺傳模式下基因型分布差異有統計學意義（P=0.000），P值經Bonferroni 校正后，差異仍有統計學意義（P=0.000）；女性病例組與對照組相比，rs3791878位點在5種不同遺傳模式下基因型分布差異均無統計學意義（P＞0.05）（表 5）。

表4 病例組與對照組 Tag-SNPs 不同遺傳模式下基因型分布的比較Tab 4 Comparison of genotype distribution of Tag-SNPs under different genetic models between case group and control group

Continued Tab

表5 病例組與對照組rs3791878位點不同遺傳模式下基因型分布的比較（按性別分層）Tab 5 Comparison of rs3791878 genotype distribution under different genetic models between case group and control group (stratified by sex)

Continued Tab

2.5 rs 3791878 位點風險基因型G/T與男性SZ發病年齡的相關性

310例男性SZ患者共有195例記錄了首次發病年齡，應用Kaplan-Meier分析rs3791878位點風險基因型G/T與195例男性患者發病年齡的相關性，結果表明G/T基因型與男性SZ的發病年齡無相關性（χ2=0.271，P=0.603）（圖 1）。

圖1 rs3791878位點風險基因型G/T與男性SZ發病年齡的相關性Fig 1 Correlation between the risk genotype G/T of rs3791878 and the age of onset in male SZ

3 討論

本研究選擇GABA通路相關基因啟動子區SNPs為研究對象，探索GAD1基因rs3791878和rs3749034位點、GABRB3基因 rs4906902位點多態性與SZ的相關性。PPI分析顯示GAD1和GABRB3存在相互作用，且均與溶質載體家族蛋白32成員A1（solute carrier family 32 member 1，SLC32A1）和突觸關聯蛋白25（synaptosomalassociated protein 25，SNAP25）有直接聯系；SLC32A1和SNAP25為GABA通路相關蛋白且與SZ發病相關[13-14]。關聯分析結果表明，rs3791878位點在超顯性遺傳模式下，G/T基因型會增加男性SZ的發病風險，且風險達1.91，但沒有得到G/T基因型提前男性SZ患者發病年齡的結果。由于本研究樣本量所限，這一結果還需要進一步在更大樣本量群體中進行驗證。本研究沒有發現rs3749034、rs4906902位點與SZ存在相關性。

Du等[15]在2008年對235個中國漢族SZ家系的研究結果也表明GAD1基因rs3791878位點與男性SZ的發生相關。結合本研究，我們認為rs3791878位點存在偏從性顯性遺傳的可能性，其雜合子的表達受到性別影響，從而增加SZ的發病風險。rs3791878位點在超顯性遺傳模式下與SZ顯著相關，其原因一方面可能與G/T基因型對轉錄起始因子與啟動子序列結合能力的改變有關，最終導致該基因表達量的改變；另一方面可能是G/T會啟動不同的蛋白質或不同亞基的表達，導致谷氨酸脫羧酶GAD67亞型活性發生改變，促進SZ的發生。

Straub等[16]認為rs3749034位點突變會導致GAD1基因啟動子區產生鋅指結構轉錄因子[ATP1A1 （Na+, K+ATPase α-1 subunit） regulatory element binding factor 6，AREB6］ 和成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MYOD）的結合位點，這2種轉錄因子能夠影響GAD67mRNA的表達。但本次研究沒有發現該位點與SZ的相關性。這一結果與Addington等[17]發現rs3749034位點參與SZ早期發病的結果不一致。也有研究[18]發現兒茶酚-O-甲基轉移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT） 基 因 Val158Met（rs4680）位點與rs3749034位點的相互作用會導致左側海馬旁回皮質的厚度減少，且只有COMTVal158Met突變位點攜帶者才表現出rs3749034位點變異的陽性結果。這說明該位點可能參與SZ的發生，但并非主導因素。

Urak等[19]認為rs4906902位點的等位基因A突變為G會改變神經元特異性轉錄激活劑N-Oct-3的結合活性。rs4906902位點與rs8179184位點緊密連鎖，單倍型G-T頻率在SZ患者組的分布顯著高于對照組[20]，但本研究沒有發現rs4906902位點與SZ的相關性，這可能是因為SZ的異質性所導致的。

本研究結果雖然表明rs3791878位點G/T基因型能夠顯著增加中國漢族男性人群SZ的發病風險，同時提示GAD1基因是中國漢族男性人群SZ的易感基因，但未涉及機制方面的研究工作。今后仍需大樣本研究進一步明確GAD1基因與SZ發生的相關性并開展相關的功能研究，以揭示其致病機制。