柴胡皂苷d對自身免疫性肝炎小鼠差異表達基因CTLA-4、IL-10和IL-17的影響

郝健亨，陳 浩，高 艷，徐慧超，高玉亭，苗宇船，郝慧琴，劉 楊

山西中醫藥大學基礎醫學院， 晉中 030619

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是由自身免疫反應介導的慢性進行性肝臟實質炎癥，以不同程度的血清轉氨酶升高、自身抗體陽性以及高γ-球蛋白血癥為主要臨床特征，組織學檢查可見界面性肝炎，伴有大量漿細胞、淋巴細胞浸潤[1]。該病多發于女性，且患病率存在顯著的地域差異，在歐美發達國家發病率較高。當前中國仍缺乏確切的AIH流行病學數據，但國內與AIH相關的文獻報道數量有明顯升高趨勢[2]。目前，已知環境因素、遺傳因素和飲食習慣與AIH的發病密切相關，但其確切的觸發因素與發展的潛在機制尚未完全闡明[3]。當前，對AIH的治療主要是依靠免疫抑制藥物和皮質類固醇藥，但這些方法有諸多不良反應，抗原特異性的免疫調控細胞回輸將可能發展成為治療AIH 最有價值的方法之一。柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SS-d）是從柴胡干燥根部提取分離出來的五環三萜類齊果烷型衍生物，具有多種藥理學作用，例如抗炎、抗病毒、免疫調節和抗肝損害等[4-5]。本研究擬采用靜脈注射刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）的方法建立AIH小鼠模型，并采用 Agilent-085631芯片對AIH相關的差異表達基因進行篩選，同時觀察SS-d對部分差異表達基因的影響，進而對AIH的發病機制以及SS-d對AIH的治療機制進行探討，為臨床上應用SS-d治療AIH提供實驗室依據。瑞公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

1.1.1 實驗動物 健康、SPF級的C57BL/6小鼠40只，鼠齡 9～10周，體質量（20±2） g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0006。將小鼠隨機分為芯片組（n=8）和SS-d治療機制組（n=32）。將芯片組隨機分為正常組和模型組（每組n=4）；SS-d治療機制組隨機分為正常組、模型組、SS-d低劑量組和SS-d高劑量組（每組n=8）。小鼠常規飼養，自由攝食，飼養溫度為22～25 ℃，濕度為58%左右，通風良好。

1.1.2 主要實驗試劑 Agilent-085631芯片（歐易生物醫學科技有限公司，中國上海），SS-d、ConA（索萊寶科技有限公司，中國北京），兔抗CTLA-4多克隆抗體（愛博泰克生物科技有限公司，中國武漢），兔抗GAPDH多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP （博士德生物工程有限公司，中國武漢），RT Master Mix （寶日醫生物技術有限公司，中國北京），ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司，中國南京）。CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA以及mGAPDHmRNA由武漢金開

1.2 實驗方法

1.2.1 AIH小鼠的模型建立及分組處理 ①基因芯片組：正常組常規飼養，模型組小鼠按15 mg/kg的劑量給予尾靜脈注射Con A；12 h后處死并提取肝組織，按Agilent-085631芯片說明書進行差異表達基因的篩選。②SS-d治療機制組：正常組常規飼養；模型組按15 mg/kg劑量給予尾靜脈注射Con A；SS-d低劑量組和SS-d高劑量組根據相關文獻[6-7]和前期預實驗結果分別按2.5和5.0 mg/kg劑量腹腔注射SS-d，8 h后按15 mg/kg劑量給予尾靜脈注射Con A。各組小鼠于造模12 h后，先通過眶內取血法收集小鼠血液并制備血清，后采用頸椎脫臼法處死全部小鼠，取出肝臟后經液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 篩選基因芯片組小鼠差異表達基因 提取小鼠肝組織總RNA，按照芯片標準流程進行樣本總RNA的定量、完整性檢測、標記，芯片的雜交、洗脫，數據的掃描、收集、整理等步驟。采用Feature Extraction軟件處理原始圖像，提取原始數據，利用GeneSpring GX軟件對原始數據進行“Quantile”標準化。過濾標準化后的數據，且用于比較的每組樣本中至少有1組75%的樣本標記為“Detected”的探針留存，進行后續分析。利用T檢驗的倍數變化值與P值對差異基因進行篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值≥2.0且P值≤0.05。對差異基因進行KEGG富集分析，并以此判定差異基因主要影響的信號轉導通路。最后，用qRT-PCR技術對部分差異表達基因CTLA-4、IL-10、IL-17進行驗證。根據反轉錄試劑盒說明書要求，將相關試劑與10 μL總RNA均勻混合（總體積為20 μL），進行反轉錄。反應條件：37 ℃×15 min，1次循環；85 ℃×5 s，1次循環（4 ℃冰箱保存反轉錄產物）。用real-time PCR 試劑盒相關試劑與2 μL反轉錄產物混合均勻（總體積為20 μL），進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ ×30 s，1次循環；95 ℃ ×5 s，60 ℃ ×34 s，40個循環。根據real-time PCR原始檢測結果，采用2-△△CT相對定量計算公式計算出各樣品目的基因的相對表達量。

1.2.3 蘇木精 - 伊紅（H-E）染色觀察SS-d治療機制組小鼠肝臟炎癥反應程度 將SS-d治療組一部分小鼠肝組織經4%多聚甲醛固定24 h后，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，RM2235型石蠟切片機切片（片厚5 μm），常規H-E染色；用中性樹膠固封，并在光學顯微鏡下觀察各實驗組小鼠肝臟炎癥反應程度。

1.2.4 微板法檢測SS-d治療機制組小鼠血清谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）含量 根據試劑盒說明書要求，采用微板法，通過SpectraMax Plus384酶標儀測定各實驗組小鼠血清GPT和GOT含量（U/L）。

1.2.5 熒光定量PCR技術檢測SS-d治療機制組小鼠肝 組 織CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA表達 取各實驗組小鼠肝組織50 mg，通過酚 - 氯仿法提取總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書要求，將相關試劑與10 μL總RNA均勻混合（總體積為20 μL），進行反轉錄。反應條件：37 ℃×15 min，1個循環；85 ℃×5 s，1個循環（4 ℃冰箱保存反轉錄產物）。用real-time PCR 試劑盒相關試劑與2 μL反轉錄產物混合均勻（總體積為20 μL），進行PCR擴增，反應條件：95 ℃×30 s，1次循環；95 ℃×5 s，60 ℃×34 s，40個循環。根據real-time PCR原始檢測結果，采用2-△△CT相對定量計算公式計算出各樣品目的基因的相對表達量。

1.2.6 ELISA技術檢測SS-d治療機制組小鼠血清IL-10、IL-17含量變化 根據各ELISA試劑盒說明書要求，通過SpectraMax Plus384酶標儀檢測各實驗組小鼠血清IL-10和IL-17吸光度值，并根據標準曲線計算上述指標的含量（pg/L）。

1.2.7 Western blotting檢測SS-d治療機制組小鼠肝組織細胞毒T淋巴細胞相關抗原（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen，CTLA） -4蛋白的表達變化 常規提取肝組織總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。配10%膠后放入電泳槽中，分別加入蛋白樣品15 μL，接通電源先以80 V、40 min進行電泳，后改為120 V跑至膠底部停止，用濕法轉將蛋白轉至PVDF膜，轉運時長2 h。取出膜放入脫脂奶粉（濃度5%）封閉2 h，把兩張膜分別放入CTLA-4一抗（濃度1:400）與GAPDH一抗（濃度1:500）4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5×5 min后，羊抗兔IgG-HRP二抗（濃度1:500）室溫搖床孵育1 h；TBST洗膜5×5 min后滴加顯影劑，通過c300化學發光成像系統掃描顯影，并利用ImageJ軟件分析。

1.3 統計學分析

應用 SPSS 25. 0 統計軟件進行實驗數據的統計與分析，所得數據以x—±s表示，采用單因素方差分析法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芯片組小鼠差異表達基因的篩選

芯片組小鼠共篩查差異表達基因11 512個，其中表達上調5 189個，下調6 323個。注釋到KEGG pathway基因共計1 567個，P≤0.05的信號通路共計138條（P值最小的前30條信號通路的氣泡圖見圖1）；表達上調基因5 189個，注釋到KEGG pathway基因共計781個，P≤0.05的信號通路共計102條（P值最小的前30條信號通路的氣泡圖見圖1）；表達下調基因6 323個，注釋到KEGG pathway基因共計789個，P≤0.05的信號通路共計77條。qRT-PCR對部分差異表達基因的驗證結果顯示，CTLA-4mRNA、IL-10mRNA、IL-17mRNA的含量變化趨勢與芯片篩選結果一致（圖2）。

圖1 芯片組小鼠差異表達基因的KEGG富集分析結果Fig 1 KEGG enrichment analysis results of differentially expressed genes in chip group

圖2 差異表達基因的qRT-PCR驗證結果Fig 2 Results of qRT-PCR verification of differentially expressed genes

圖3 SS-d治療機制組小鼠肝臟H-E染色結果Fig 3 Results of H-E staining of liver in SS-d treatment group

2.2 SS-d治療機制組小鼠肝臟炎癥反應程度

正常組小鼠肝細胞正常，肝小葉結構完整清晰，肝索排列有序整齊；模型組可見肝細胞腫脹、變性、壞死，并伴有大量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，SS-d低劑量組小鼠肝組織內淋巴細胞浸潤減輕，肝細胞壞死程度降低；SS-d高劑量組病理變化改善更為明顯（圖3）。

2.3 SS-d治療機制組小鼠血清GPT和GOT的含量變化

與正常組比較，模型組血清中 GPT和GOT顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SS-d高劑量組GPT、GOT顯著降低（P＜0.05）；SS-d高劑量組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 SS-d治療機制組小鼠血清GPT和GOT含量變化Fig 4 Serum GPT and GOT levels in SS-d treatment group

2.4 SS-d治療機制組小鼠肝組織 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表達變化

正常組小鼠肝組織中CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達量最高，IL-17mRNA表達量最低；模型組與正常組比較，CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達量顯著降低，IL-17mRNA表達量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；但SS-d高劑量組與正常組比較，表達差異無統計學意義（P＞0.05）；相比于模型組，2個治療組CTLA-4mRNA和IL-10mRNA表達量均有不同程度的升高，而IL-17mRNA表達量均有不同程度的降低，其中SS-d高劑量組與模型組的差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 SS-d治療機制組小鼠肝組織 CTLA-4、IL-10和IL-17 mRNA表達量的變化Fig 5 Changes of CTLA-4, IL-10 and IL-17 mRNA in liver tissues of mice in SS-d treatment group

2.5 SS-d治療機制組小鼠血清IL-10和IL-17含量的變化

與正常組比較，AIH模型組血清中 IL-17含量顯著升高（P＜0.05），IL-10含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SS-d高劑量組IL-17含量顯著降低（P＜0.05），而IL-10含量顯著升高（P＜0.05）；SS-d高劑量組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖6）。

圖6 SS-d治療機制組小鼠血清IL-10和IL-17含量的變化Fig 6 Changes of serum IL-10 and IL-17 levels in SS-d treatment group

2.6 SS-d治療機制組小鼠肝組織CTLA-4蛋白的表達變化

與正常組小鼠比較，模型組小鼠肝組織CTLA-4蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組肝組織中CTLA-4蛋白表達量均有所增高（P＜0.05），SS-d高劑量組增高更為明顯；但SS-d高劑量組與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；SS-d低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖 7）。

圖7 SS-d治療機制組小鼠肝組織CTLA-4蛋白的表達變化Fig 7 Changes of CTLA-4 protein expression in liver tissues of mice in SS-d treatment group

3 討論

AIH是一種免疫介導的進行性肝損傷，臨床表現可以從輕度或重度癥狀發展成為肝衰竭。患者血清轉氨酶水平升高，組織學上表現為界面肝炎和漿細胞的存在，血清學上表現為免疫球蛋白G水平升高。AIH可以影響任何年齡段人群，主要以中年女性居多，其發病率也因地域而異。當前AIH的發病機制尚不明確，有證據表明遺傳和環境因素都與其有緊密關聯；同時，外周自我耐受性破壞，FOXP3+調節性T細胞功能受損，以及效應細胞對組織水平抑制的抵抗在AIH免疫病理發生中起重要作用[3]。本實驗結果表明，AIH的發病過程非常復雜，系多條信號通路的活性發生改變的共同作用結果。本次實驗選用的是ConA誘導的小鼠肝損害模型，ConA作為一種植物血凝素，能有效刺激T細胞并迅速誘導T細胞的活化和浸潤[8-11]。H-E染色結果顯示，經尾靜脈注射ConA后，AIH小鼠肝臟內門管區及肝小葉中央靜脈可見大量淋巴細胞浸潤，肝小葉內部分肝細胞變性、腫脹、壞死，同時伴有血清GPT和GOT的顯著升高，均提示ConA可通過誘導淋巴細胞活化攻擊自身肝組織，進而促進AIH的發生和發展。因此，本次實驗選擇T細胞受體信號轉導通路以及Th17細胞分化信號通路的部分差異表達基因（CTLA-4、IL-10和IL-17）作為后續驗證AIH發病機制以及SS-d治療機制的靶點。

Th17細胞是代表T輔助淋巴細胞的特殊子集，不僅參與黏膜和上皮屏障的抗微生物免疫，而且還是腫瘤發生的關鍵細胞成分，參與腫瘤的發生和發展[12-13]。同時，Th17細胞是免疫應答的正調節因子。一方面，它能產生包括IL-17A、IL-17F和IL-22在內的多種促炎細胞因子，這些細胞因子的產生不僅促進免疫細胞（如中性粒細胞和淋巴細胞）在炎癥部位的積累，而且還可以引起組織病理學改變[14]。另一方面，Th17細胞可有效促進Treg的擴增和表型穩定[15]。Th17細胞與AIH發病機制密切相關。有研究[16]證實：AIH患者的血清IL-17水平和肝內Th17細胞的頻率顯著高于健康對照者，并且AIH患者肝臟中IL-17+淋巴細胞浸潤（主要表現為CD4+表型）明顯增加，肝臟IL-17+細胞浸潤程度與AIH患者的肝臟纖維化和炎癥程度呈正相關；同時，IL-17也被證明通過肝細胞中的絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導IL-6表達。多種證據[17]表明，Th17細胞增殖是AIH發病的關鍵觸發因素，Th17細胞與肝細胞之間的正反饋回路加劇炎癥過程。Th17細胞特征在于IL-17大量產生，IL-17通過介導T細胞和炎癥細胞在組織中的浸潤，與干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細胞因子協同發揮作用，促進T細胞的活化，進而產生炎癥性破壞并放大靶器官的免疫反應，參與AIH等多種免疫性疾病的發生和發展[18]。Th17細胞和IL-17信號通路在AIH的發病機制中有重要作用。Treg是免疫耐受和炎癥反應的重要調節因子，主要通過下調機體的免疫應答維持自身耐受。一方面，它產生抗炎細胞因子如IL-10來抑制免疫反應；另一方面，它可以通過表達CTLA-4（在小鼠中具有從APC反式內吞CD80/CD86的能力），從而防止APC 激活和效應T細胞擴增[15]。同時，Treg還可以在體外和體內促進Th17細胞的分化，從而增強Th17細胞的功能性后果（對宿主防御的保護作用，以及對炎癥和腫瘤生長的不利作用）。Treg細胞組成性地表達CTLA-4。CTLA-4是T細胞應答的重要負調節因子，主要通過下調T細胞活化維持機體組織器官的免疫耐受。CTLA-4的表達或功能異常參與AIH的發病過程。IL-10是一種具有強抗炎作用的細胞因子，在限制宿主對病原體的免疫反應，從而防止對宿主的損害和維持正常組織穩態方面發揮著核心作用。IL-10的失調與AIH發展風險的增加有關[19]。CTLA-4和IL-10作用機制類似[20]。研究[21]證實，IL-10的抑制作用與CTLA-4和B7分子結合發揮負向免疫調節作用有密切關系。

總之，IL-17、CTLA-4和IL-10三者都是調節免疫功能活性所必需的，與AIH的發病機制有緊密關聯。本實驗結果顯示，相較于正常組，AIH模型組小鼠肝組織中CTLA-4蛋白表達水平顯著降低，CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達量明顯下降，模型組血清中IL-10含量降低，表明CTLA-4和IL-10共同參與AIH在小鼠體內發病過程，即通過參與免疫反應的負調節來維持機體的免疫自穩。對比正常組，模型組血清中IL-17含量明顯升高，IL-17 mRNA表達量增高。由此可推測，Th17和Treg的平衡可能與AIH發病有關，其中CTLA-4、IL-10和IL-17表達的變化在AIH發生和發展中起著關鍵的作用。

中藥柴胡始載于《神農本草經》，主要入藥部位在根部，有解郁疏肝、解表泄熱、升陽氣的作用，目前已廣泛用于治療亞洲國家的幾種肝病。SS-d是從柴胡中提取的三萜皂苷，并被認為是從柴胡中分離出的各類柴胡皂苷中最活躍的一種，具有抗腫瘤、抗過敏、抗凋亡和免疫調節活性等多種藥理學作用；此外，SS-d還具有明顯的抗炎活性。在細胞因子水平上，SS-d能抑制促炎細胞因子，包括TNF-α和IL-6等；同時，可以提高抗炎細胞因子的表達，如轉化生長因子β1和IL-10等[22]。既往研究[23]表明，SS-d對T細胞有絲分裂原具有調節T細胞功能和抑制淋巴細胞增殖的作用。之后，有研究[24]表明，SS-d不僅能抑制OKT3/CD28共刺激的人T細胞增殖，而且在體外抑制PMA、PMA/Ionomycin和Con A誘導的小鼠T細胞活化，SS-d對PMA誘導的T細胞活化的抑制作用與通過抑制IKK和Akt活性而下調NF-κB信號有關。本次實驗結果顯示AIH模型組CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達量最低，IL-17 mRNA表達量最高。相較于AIH模型組，SS-d低劑量組和SS-d高劑量組CTLA-4 mRNA和IL-10 mRNA表達量隨劑量加大有上升趨勢，而IL-17 mRNA表達量則逐步下降；并且，H-E染色結果顯示，2個治療組小鼠肝組織炎癥反應不同程度減輕，肝細胞壞死情況得到不同程度改善。相較于模型組，SS-d低劑量組和SS-d高劑量組CTLA-4蛋白表達水平隨劑量加大逐步升高；并且對比模型組，治療組中血清GPT、GOT和IL-17水平有不同程度降低，IL-10呈逐步升高趨勢。以上結果說明SS-d治療AIH的作用機制與CTLA-4、IL-10和IL-17的表達變化有關，它通過刺激肝細胞內CTLA-4和抑炎因子IL-10的表達，降低T細胞的活化程度，發揮免疫調節作用，并通過抑制促炎因子IL-17的表達降低炎癥反應對肝臟的損害作用。

綜上所述，在AIH早期，各種致病因素可以導致T細胞受體信號通路活性發生變化，引起T細胞的異常激活，從而誘發肝臟損害；而SS-d可通過調節T細胞受體信號轉導通路以及Th17細胞分化信號通路中部分基因如IL-10、CTLA-4、IL-17的表達，抑制炎癥反應對肝臟的損害，改善AIH小鼠肝功能。