CD8+ T細胞在葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠急性結腸炎中的致病性研究

曾群雄 ，鄧 軍 ，沈 南

1. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海市風濕病學研究所，上海200127；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院中澳個體化自身免疫病研究中心，上海200127

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是腸道黏膜內免疫反應的異常激活導致的。多種免疫細胞亞群參與IBD發病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）等慢性復發性胃腸道炎癥[1-3]。目前，許多研究證明CD4+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的異常活化與IBD患者腸道黏膜內炎癥反應有關[1-2,4-5]。這些促炎癥細胞通過分泌趨化因子、促炎細胞因子及效應性分子參與和維持炎癥反應，加重腸道破壞[1-2,6]。調節性細胞，如調節性T細胞（Treg）、分泌白介素（IL） -10的調節性B細胞抑制炎癥反應，減輕腸道炎癥[7-8]。即便如此，IBD的發病機制仍然不清楚，有待進一步研究[9]。

近年來，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI），如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）阻斷抗體（Ipilimumab）、程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）阻斷抗體（Nivolumab/Pembrolizumab）或程序性死亡受體配體1（PD-1 ligand，PD-L1）的阻斷抗體對腫瘤患者的療效顯著[10]。但接受ICI治療后，部分腫瘤患者出現嚴重的免疫相關不良事件（immune-related adverse events，irAEs）， 自 Nivolumab、Pembrolizumab 和Atezolizumab等藥物上市以來，有關ICI治療后致死的報道不斷增加。Ipilimumab單藥治療時，致死性irAEs中結腸炎/腹瀉非常普遍。抗PD-1/PD-L1單藥使用也可以導致嚴重的結腸炎，聯合療法致死數量顯著增加。以上研究表明，應對接受ICI治療的患者引起的致死性irAEs的風險進行全面評估，深入研究胃腸道免疫相關不良事件的發生機制。ICIs治療的免疫原理是重新激活耗竭的CD8+T細胞，增強效應分子的表達以殺傷腫瘤細胞。因而，我們推測激活的CD8+T細胞參與胃腸道免疫相關不良反應。葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的小鼠結腸炎模型，符合人類IBD患者腸道炎癥和發病機制的主要特征，也是目前研究腸道炎癥使用最廣泛的實驗動物模型[11-12]。因此，本研究擬使用DSS誘導的結腸炎模型，初步探討CD8+T細胞在結腸炎中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級C57BL/6野生型（WT）雄性小鼠46只，鼠齡8～10周，體質量24～26 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，動物生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。將WT小鼠隨機進行分組：未造模組（n=6）、經2%（質量濃度，下同）DSS誘導結腸炎組（n=14）、3% DSS誘導結腸炎組（n=16）和4%DSS誘導結腸炎組（n=10）。

B6.129S2-Cd8atm1Mak/J （編號002665） CD8敲除小鼠（簡稱CD8-/-小鼠）34只，性別、鼠齡與野生型小鼠相同，體質量25～27 g，由美國The Jackson Laboratory提供。CD8-/-小鼠分組：2% DSS誘導組（n=14）、3% DSS誘導組（n=12）和4%DSS誘導組（n=8）。

實驗小鼠飼養在上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物屏障設施內，動物使用許可證號為SYXK（滬）2016-0009。小鼠飼以60Co輻照殺菌飼料，自由進食。飼養條件：溫度22～24 ℃，空氣相對濕度40%～60%，光照周期為12 h/12 h。本研究的動物飼養條件符合相應實驗動物等級標準，所有動物相關操作均按照上海交通大學醫學院附屬仁濟實驗動物倫理委員會的規定執行。

1.2 主要試劑和儀器

DSS（MP Biomedicals，美國），4%多聚甲醛（谷歌生物，中國），QuantStudio 7熒光定量PCR儀（ABI，美國），TRIzol試劑（Invitrogen，美國），超凈工作臺、CO2培養箱（Thermo Scientific，美國），光學顯微鏡（Nikon，日本），cDNA反轉錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本），Aperio切片掃描儀（Leica，德國），EVOS FL細胞成像系統（Thermo Fisher，美國），BZX710熒光顯微鏡（Keyence，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性結腸炎模型的誘導 用高壓滅菌的雙蒸水配制質量濃度為2%～4%的DSS溶液，WT小鼠和CD8-/-小鼠連續飼喂DSS 溶液7 d，然后更換為正常飲水喂養至實驗終點，監測小鼠存活情況，繪制生存曲線至誘導后第14日。每日測量小鼠體質量。疾病活動指數（diseases activity index，DAI）為以下3項參數的平均值：①糞便稠度（無腹瀉為0分，糞便變軟為2分，明顯腹瀉為4分）。②血便（無出血為0分，可疑陽性為2分，肉眼可見血便為4分）。③體質量變化（無體質量減輕為0分，體質量減輕1%～5%為1分，體質量減輕6%～10%為2分，體質量減輕11%～20%為3分，體質量減輕超過20%為4分）。

1.3.2 結腸組織病理觀察和評分 2%DSS誘導小鼠急性結腸炎后第10日，收集WT小鼠和CD8-/-小鼠遠端結腸，用4%多聚甲醛固定24 h后石蠟包埋，連續切片（6 μm），然后用蘇木精 - 伊紅（H-E）染色。小鼠組織病理學評分采用雙盲方法[13]，觀察2%DSS處理后WT小鼠和CD8-/-小鼠腸道炎癥反應程度，包括隱窩結構破壞和喪失（正常為0分，隱窩位于黏膜上為1分，嚴重隱窩結構異常為2分，整個隱窩丟失為3分）、炎癥細胞浸潤程度（正常為0分，明顯炎癥浸潤為3分）、肌層增厚（無增厚為0分，明顯的肌層增厚為2分，肌層透壁性壞死為3分）、隱窩膿腫（不存在為0分，存在為1分，中度為2分，重度為3分）和杯狀細胞耗竭（不存在為0分，存在為1分，中度為2分，重度為3分）。小鼠組織病理學評分為以上3項評分的平均值。

1.3.3 實時熒光定量PCR 2%DSS誘導小鼠急性結腸炎后第10日，收集小鼠中段結腸組織，于液氮速凍后通過酚-氯仿法提取總RNA。根據反轉錄試劑說明書要求，取400 ng RNA反轉錄為cDNA。促炎癥和抑炎癥細胞因子mRNA表達水平用SYBR染料和實時熒光定量PCR儀檢測。根據實時熒光定量PCR原始檢測結果，以β-actin作為內參基因，用2-ΔΔCt方法進行定量分析。基因引物序列見表1。

1.4 免疫熒光染色觀察結腸黏膜固有層中CD8+ T細胞浸潤情況

2% DSS誘導后第10 日，收集小鼠遠端結腸組織，用封閉液（1% BSA）封閉60 min，一抗（大鼠抗小鼠CD8，Abcam）4 ℃孵育過夜，二抗使用驢抗大鼠Alexafluor 488（Thermo Fisher）。細胞核用DAPI染色。采用EVOS FL細胞成像系統和BZ-X710熒光顯微鏡拍照，采用Photoshop CS4（Adobe）分析。

1.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.2軟件進行統計學分析，定量資料采用x—±s表示。通過對數秩檢驗（Log Rank）進行生存曲線分析，采用Mann-WhitneyU檢驗、單因素方差分析對數據進行統計分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

2 結果

2.1 DSS誘導的小鼠結腸炎發病情況

2% DSS誘導后第3～10日，WT小鼠體質量持續急劇下降，但CD8-/-小鼠體質量在第3～8日下降速度較慢，且在第9日呈現上升趨勢（圖1A）。野生型小鼠在誘導急性結腸炎后表現出更為嚴重的結腸炎癥狀，包括精神不振、肛門粘連、嚴重的腹瀉和大量血便。CD8-/-小鼠DAI較WT小鼠明顯降低（圖1B）。結腸長度縮短通常被視為結腸損傷的宏觀參數，WT小鼠結腸長度比CD8-/-小鼠減少近30%（圖1C）。H-E染色觀察結果顯示，WT小鼠腸道病理改變較CD8-/-小鼠嚴重，結腸隱窩結構幾乎全部喪失、黏膜下層伴隨大量淋巴細胞浸潤。與WT小鼠比較，CD8-/-小鼠腸道黏膜結構較完整，組織病理學評分顯著降低（圖1D、1E）。

2.2 高濃度 DSS誘導急性結腸炎小鼠存活情況

WT和CD8-/-小鼠經4%DSS誘導腸炎后，均出現腹瀉和血便，體質量明顯下降。CD8-/-小鼠體質量下降幅度較小（圖2A），結腸長度較WT小鼠長（圖2B）。WT組小鼠在第7日全部死亡，CD8-/-組全部存活（圖2C）。DSS誘導的結腸炎嚴重程度可隨著DSS給藥時間及濃度增加而增加，將小鼠體質量減輕超過初始體質量30%視為應激指標，此時應達到動物實驗倫理終點。因此，后續實驗使用3% DSS評估CD8-/-小鼠存活情況。結果顯示，WT小鼠存活率僅為37.5%（6/16），而CD8-/-小鼠存活率為66.7%（8/12），約為WT小鼠存活率的2倍（圖2D）。

圖1 2%DSS誘導后小鼠體質量、結腸長度和組織病理學變化Fig 1 Weight loss, colon shortening and histopathology changes in 2% DSS-induced mice

圖2 高濃度DSS誘導后小鼠體質量、結腸長度變化及存活情況Fig 2 Changes of weight, colon length and survival rate of mice induced by high concentration of DSS

2.3 CD8-/-小鼠結腸炎癥因子表達變化

2% DSS誘導腸炎后第10 日，RT-PCR檢測結果（圖3）顯示：WT小鼠結腸組織中的促炎癥細胞因子Il1b、Il6、Il17a、Ifng和TnfmRNA表達水平顯著高于CD8-/-小鼠（均P＜0.05）。2組抑炎癥細胞因子Il10、Tgfb1和Foxp3mRNA表達水平的差異無統計學意義（均P＞0.05）。

圖3 CD8-/-小鼠和WT小鼠結腸組織中炎癥細胞因子表達水平（n=8）Fig 3 Expression of inflammatory cytokines in colon tissues of CD8-/- mice and WT mice (n=8)

2.4 DSS誘導后結腸黏膜固有層中CD8+ T細胞浸潤情況

使用2%DSS誘導結腸炎后第10日，WT小鼠免疫熒光染色檢測結果顯示：WT小鼠腸道固有層中可以見到浸潤大量的CD8+T細胞（n=10），與未造模組（n=6）小鼠比較，差異具有統計學意義（P=0.001），見圖4。

圖4 DSS誘導的結腸炎小鼠結腸黏膜固有層中CD8+ T細胞浸潤情況Fig 4 CD8+ T cells infiltration in colon lamina propria of mice with DSS-induced colitis

3 討論

作為適應性免疫調節的重要組成部分，CD8+T細胞在腫瘤和慢性感染中的作用和機制被廣泛研究；而對于其在慢性炎癥和自身免疫性疾病中的作用關注較少，特別是CD8+T細胞在結腸炎中的作用鮮有報道[14]。IBD的發病機制尚不完全清楚，通常認為與遺傳、免疫功能紊亂、腸道屏障功能破壞、組織損傷等有關[1,5]。本研究結果提示，在DSS誘導的小鼠結腸炎模型中，CD8+T細胞浸潤到結腸黏膜固有層，CD8-/-小鼠存活率升高，體質量降低幅度較小。結腸組織病理學改變顯示，CD8-/-小鼠腸道黏膜破壞減輕，隱窩結構相對完整，浸潤到腸道中炎癥細胞數量減少，炎癥程度減輕。

在接受ICI治療的腫瘤患者中，發生胃腸道免疫相關iRAEs者，經胃腸鏡活檢發現胃和十二指腸上皮內CD8+T細胞浸潤顯著增多，提示為CD8+T細胞參與PD-1阻斷治療導致的胃腸炎不良事件[15]。本研究中，通過DSS誘導小鼠急性結腸炎模型發現，WT小鼠結腸黏膜固有層中CD8+T細胞浸潤數量顯著增加，小鼠腸炎癥狀較重，而在CD8-/-小鼠急性結腸炎癥狀減輕。Smillie等[16]發現，與健康人群比較，IBD患者腸道黏膜中產生IL-17的CD8+T細胞會隨著疾病的發生和發展而增加，而且是黏膜樣本中產生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IL-17的主要來源，提示這群CD8+T細胞可能參與并造成腸道黏膜的組織損傷和結構破壞。此外，IBD患者外周血中CD8+T細胞PD-1、CTLA-4等免疫抑制性基因模塊的高表達，預示著更好的臨床轉歸和較低的疾病復發概率[17]。并且，IBD患者外周血CD8+T細胞的轉錄組學特征可以作為生物標志物應用于疾病預后評估，從而指導IBD患者的臨床治療策略[18-19]。有研究發現，在IBD 患者的腸道中CD8+T細胞仍能夠被T細胞信號激活并表達高水平的顆粒酶B、TNF-α和干擾素γ等效應分子，提示這些細胞可能是具有效應表征的細胞亞群[20]。可見，CD8+T細胞具有可塑性，并且在腸道黏膜穩態與炎癥中的作用非常復雜，亟待進一步研究。

綜上所述，在DSS誘導的小鼠急性腸炎模型中，WT小鼠造模后CD8+T細胞浸潤到結腸黏固有層中并且加重結腸炎病理改變，CD8-/-小鼠存活率升高，體質量降低幅度較小，結腸破壞較輕，結腸組織中促炎癥因子水平降低，證明了CD8+T細胞在急性結腸炎中的致病性。但是，其具體機制仍有待進一步研究。