阿魏酸對2型糖尿病小鼠心肌損傷的影響

王一春，王麗娟，劉萍△

近年來，糖尿病（diabetes mellitus，DM）發病率逐年升高，已成為危害人類健康的主要慢性疾病之一［1］。國際糖尿病聯盟研究項目報道，2017 年全球糖尿病患者約有4.51億，預計2045年全球糖尿病患者 將 達 到 6.93 億［2］。 糖 尿 病 心 肌 病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作為糖尿病并發癥之一，主要病理改變為心肌細胞凋亡和左心室肥厚，間質和血管周圍組織纖維化，最終發展為心力衰竭，已成為糖尿病患者的主要致死原因［3］。DCM發病機制尚不清楚，高血糖、炎癥反應、心肌細胞肥大及纖維化、氧化應激、血管內皮損傷等多種因素均可能參與DCM的發生發展［4-5］，因此，尋找安全、有效控制 DCM 的藥物，已成為研究的焦點。阿魏酸（ferulic acid）是從阿魏、川芎、木賊、升麻等多種中藥提取出的有效單體，具有較強的抗氧化能力，在抗腫瘤、抗氧化、解毒、保肝等方面發揮著巨大的作用，因其性質穩定、毒性低受到人們的廣泛關注［6］。有研究報道，阿魏酸具有抗氧化和降血糖作用，對大鼠氧化應激介導的糖尿病心肌病有一定的治療作用［7］。本研究通過動物實驗，探討阿魏酸對2 型糖尿病小鼠心肌損傷的保護作用及其作用機制，為阿魏酸臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 阿魏酸（128707）購自美國Sigma公司，糖基化終末代謝產物（advanced glycation end products，AGEs）ELISA 試劑盒（JYM0171MO）購自武漢基因美生物技術有限公司，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR-4）抗體（ab22048）、核轉錄因子-?B（nuclear factor kappa B，NF-?B）抗體（ab16502）均購自英國Abcam公司，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3抗體（NACHT-LRR-PYD-containing protein 3，NALP3，A12694）購自中國ABclonal公司，β-actin抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（ZB-2301）、兔二步法試劑盒（PV-6001）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蛋白提取試劑盒（R0050）、Masson試劑盒（G1345）均購自北京索萊寶生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒（K1622）、ECL化學發光試劑盒（32106）均購自賽默飛世爾生物技術有限公司，實時熒光定量PCR（Q-PCR）試劑盒（RR820A）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，全自動生化分析儀（IDEXX Cataiyst One）購自愛德士緬因生物制品貿易（上海）有限公司，Q-PCR儀（CFX96）、濕轉印儀、垂直電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 2 型糖尿病db/db 小鼠和正常db/m小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，體質量18～21 g，4～6周齡，雄性，SPF級。飼養與實驗均在寧夏醫科大學實驗動物中心。db/db 小鼠適應性飼養1 周后，檢測血糖，篩選出糖尿病小鼠20只，按小鼠體質量進行編號，隨機數字表法分為模型組和阿魏酸組，每組10只；采用相同方法隨機抽取10只同周齡的db/m小鼠作為對照組。對照組和模型組灌胃蒸餾水，阿魏酸組灌胃阿魏酸（30 mg/kg）至8周，每天灌胃1 次，8 周后處死［8］，取出完整小鼠心臟，稱量心臟質量，計算心臟質量指數（心臟質量指數=小鼠心臟質量/小鼠體質量）。

1.2.2 心肌HE 染色、Masson 染色 取相同部位心臟組織，10%福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3 μm 連續切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗。常規HE、Masson染色，400倍光鏡下觀察心臟組織形態變化。

1.2.3 外周血血糖（BG）、肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）、AGEs 檢測 末次給藥后，吸入麻醉小鼠，迅速摘取眼球取血，分離血清。用全自動生化分析儀測定血清中BG、CK和CK-MB的水平，采用酶聯免疫吸附法測定AGEs表達水平。

1.2.4 Q-PCR檢測 采用Trizol一步法從心臟組織中提取總RNA，采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，取反轉錄產物2 μL作為模板，應用 Q-PCR 儀進行擴增。TLR-4、NF-?B 和NALP3部分片段的引物采用Premier 5.0軟件進行設計，引物序列見表1。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s共40個循環，最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存，以GAPDH 為內參，每組樣本設置3 個復孔，采用2-ΔΔCt法表示TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA相對表達量，實驗重復3次后進行統計分析。

1.2.5 免疫組化染色檢測 石蠟包埋的心臟組織經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗，抗原修復后，滴加TLR-4（1∶50）、NF-?B（1∶200）、NALP3（1∶100）4 ℃孵育過夜；室溫復溫漂洗后，滴加相對應的二抗37 ℃孵育30 min，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，DAB 顯色，蒸餾水沖洗終止反應，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察TLR-4、NF-?B、NALP3表達情況，陽性反應為棕黃色或黃色顆粒。應用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統測量TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白的平均光密度值。

1.2.6 Western blot 檢測 提取100 mg小鼠心臟組織，加入1mL RIPA裂解液、5 μL磷酸酶抑制劑、5 μL蛋白酶抑制劑，震蕩離心30 s，冰上靜置 5 min，重復4 次，12 000 r/min 離心15 min后取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。定量上樣蛋白60 μg，加5×上樣緩沖液，蛋白變性、電泳、轉膜，含5%脫脂牛奶的 PBST 封閉緩沖液封閉 2 h，加入 TLR-4（1∶500）、NF-?B（1∶1 000）、NALP3（1∶500）、β-actin（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗 3 次，對應的二抗（1∶5 000）溫室孵育 1 h，TBST 漂洗3 次，加入超敏ECL 化學發光劑顯影。采用Image J圖像處理系統計算樣本條帶灰度值。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 進行統計學分析，計量資料均采用均數±標準差（）表示，多組樣本均數間的比較采用方差分析，組間多重比較采LSD-t法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠心臟質量指數比較 模型組小鼠體質量、心臟質量和心臟質量指數較對照組明顯增高（均P＜0.05），阿魏酸干預后，體質量、心臟質量和心臟質量指數較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Heart mass index of three groups of mice表2 各組小鼠心臟質量指數 （n=10，）

Tab.2 Heart mass index of three groups of mice表2 各組小鼠心臟質量指數 （n=10，）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對照組模型組阿魏酸組F體質量（g）22.819±1.725 44.835±2.575a 41.049±1.911ab 313.578＊＊心臟質量（mg）92.477±6.486 216.930±22.641a 172.607±22.475ab 112.630＊＊心臟質量指數（mg/g）4.057±0.157 4.830±0.282a 4.194±0.370b 21.156＊＊

2.2 各組小鼠心臟組織形態學改變 HE和Masson染色顯示，對照組心肌細胞形態完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，細胞核大小一致，無明顯結構改變和間質纖維化。模型組心肌細胞腫脹肥大，心肌纖維排列紊亂，細胞核大小不一，可見明顯纖維增生。阿魏酸組心肌細胞腫脹情況較模型組明顯減輕，細胞形態較完整，心肌纖維排列較整齊，心肌纖維增生情況明顯好轉，見圖1。

2.3 各組小鼠血清BG、CK、CK-MB、AGEs 水平比較 模型組血清BG、CK、CK-MB、AGEs表達水平明顯高于對照組（均P＜0.05），阿魏酸干預后，血清BG、CK、CK-MB、AGEs 表達水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表3。

2.4 Q-PCR 檢 測 心 臟 組 織 中 TLR-4、NF- ?B、NALP3 mRNA 表達情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA 表達水平較對照組明顯升高（均P＜0.05），阿魏酸干預后，TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表4，圖2。

2.5 免疫組化染色檢測 TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達水平明顯高于對照組（均P＜0.05），阿魏酸干預后，TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表5，圖3。

2.6 Western blot 檢測 TLR-4、NF-?B、NALP3 蛋白表達情況 模型組TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達水平明顯高于對照組（均P＜0.05），阿魏酸干預后，TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達水平較模型組明顯降低（均P＜0.05），見表6，圖4。

Tab.3 Expression levels of serum BG,CK,CK-MB and AGEs in three groups of mice表3 各組小鼠血清中BG、CK、CK-MB、AGEs水平 （n=5，）

Tab.3 Expression levels of serum BG,CK,CK-MB and AGEs in three groups of mice表3 各組小鼠血清中BG、CK、CK-MB、AGEs水平 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對照組模型組阿魏酸組F BG（mmol/L）5.031±0.535 21.250±0.652a 15.711±0.591ab 961.327＊＊CK（U/L）504.080±17.266 691.963±26.148a 583.520±21.194ab 93.240＊＊CK-MB（U/L）106.877±9.969 221.625±15.053a 148.489±13.074ab 101.872＊＊AGEs（ng/L）123.270±13.074 206.493±12.128a 167.403±14.515ab 49.188＊＊

Tab.4 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 mRNA in heart cells detected by Q-PCR表4 Q-PCR檢測心臟組織TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達情況 （）

Tab.4 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 mRNA in heart cells detected by Q-PCR表4 Q-PCR檢測心臟組織TLR-4、NF-?B、NALP3 mRNA表達情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 1 4.670±0.288a 0.788±0.052b 499.890＊＊NF-?B 1 5.027±0.248a 0.883±0.024b 807.922＊＊NALP3 1 4.520±0.727a 0.673±0.079b 76.555＊＊

Tab.5 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by immunohistochemical staining表5 免疫組織化學染色檢測心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達情況 （）

Tab.5 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by immunohistochemical staining表5 免疫組織化學染色檢測心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 0.348±0.020 0.613±0.022a 0.441±0.007ab 176.664＊＊NF-?B 0.305±0.020 0.552±0.020a 0.467±0.024ab 102.435＊＊NALP3 0.272±0.038 0.580±0.044a 0.418±0.055ab 33.140＊＊

Tab.6 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by Western blot assay表6 Western blot 法檢測心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達情況 （）

Tab.6 The expressions of TLR-4,NF-?B and NALP3 protein in heart tissues detected by Western blot assay表6 Western blot 法檢測心臟組織中TLR-4、NF-?B、NALP3蛋白表達情況 （）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比較，b與模型組相比較，P＜0.05

組別對照組模型組阿魏酸組F n3 3 3 TLR-4 0.333±0.014 0.516±0.021a 0.397±0.008ab 109.000＊＊NF-?B 0.926±0.018 1.021±0.017a 0.818±0.009ab 138.511＊＊NALP3 0.892±0.008 1.028±0.018a 0.877±0.047b 23.970＊＊

3 討論

3.1 阿魏酸對糖尿病進展影響的研究現狀 近年來，糖尿病發病率逐年上升，已成為除腫瘤、冠心病、腦血管病之外第四大威脅人類健康的慢性疾病［9］，可引起心肌細胞代謝紊亂、心肌細胞壞死及組織纖維化，最終導致糖尿病心肌病的發生［10］，糖尿病患者心血管疾病和心力衰竭的發病率是非糖尿病患者的2～3 倍［11］。阿魏酸在保護心肌缺血、增加冠脈血流量等方面發揮著重要的作用［6］。糖尿病心肌病發病機制復雜，高血糖導致的氧化應激引起的血管內皮細胞和平滑肌細胞損傷是糖尿病心肌病形成的關鍵，長期高血糖狀態會抑制心肌細胞對葡萄糖的利用，促進脂肪酸氧化，進而引起心肌細胞損傷［12］。本研究發現，阿魏酸干預后，糖尿病小鼠血糖水平明顯降低，提示阿魏酸可能具有一定的降糖作用。

3.2 阿魏酸對2 型糖尿病小鼠心肌損傷的保護作用 本研究顯示，糖尿病可導致小鼠心臟質量指數升高、心肌細胞肥大和心肌纖維化，而阿魏酸干預后，心臟質量指數明顯降低，心肌細胞腫脹和纖維增生情況明顯好轉，提示阿魏酸可能緩解2 型糖尿病造成的心肌細胞纖維化，對心肌細胞損傷具有一定的治療作用，這與Chowdhury 等［7］的研究結果一致，但本研究并未探討阿魏酸對糖尿病小鼠心肌肥厚情況的影響，有待進一步研究。CK、CK-MB 是特異性心肌酶，被廣泛認為是心肌損傷的重要標志物，其升高程度與心肌損傷程度密切相關，可以反映心肌細胞損傷程度［13］。高血糖環境下AGEs 產生增多，AGEs會引起心肌細胞凋亡和內質網應激反應，而心肌細胞凋亡和內質網應激反應是糖尿病心肌病發生發展的重要環節，AGEs在糖尿病心肌病中發揮著重要的作用［14-15］。本研究發現阿魏酸對糖尿病引起的心肌損傷具有一定的治療作用，它可能通過抑制AGEs表達，阻止AGEs對心臟血管的損害，進而達到改善糖尿病小鼠心肌損傷的作用，。

3.3 阿魏酸對2 型糖尿病小鼠心肌組織中TLR-4、NF-?B、NALP3 表達的影響 TLR-4 作為一種模式識別受體，在心血管內皮細胞和心肌細胞中廣泛分布。大量研究表明，TLR-4/NF-?B 信號通路與心血管疾病的發生密切相關，TLR-4 可經細胞內傳導通路進入細胞核內，激活NF-κB，誘導細胞釋放大量炎性因子，導致炎癥反應的發生，引起心肌細胞壞死、心肌梗死面積增大、心功能降低［16］。本研究提示阿魏酸可能通過抑制TLR-4/NF-?B/NALP3信號通路，使心肌細胞中TLR-4、NF-?B、NALP3 活性降低，抑制炎癥反應，減少心肌損害，進而達到保護心肌的作用。此外，本研究并未檢測小鼠血清中炎癥因子的表達情況，TLR-4/NF-?B/NALP3信號通路在心肌損傷保護作用中的具體作用機制有待進一步研究證實。

綜上所述，阿魏酸具有改善2 型糖尿病小鼠血糖水平，減輕心肌細胞損傷及心肌纖維化的作用，它可能通過抑制TLR-4/NF-?B/NALP3信號通路，抑制炎癥反應，減少心肌損害，進而達到保護心肌的作用。