凡納濱對蝦微衛星分子標記的開發及不同養殖家系遺傳多態性分析
2020-04-14 04:59:03李強勇李旻曾地剛朱威霖彭敏楊春玲劉青云趙永貞陳秀荔陳曉漢
南方農業學報 2020年2期
李強勇 李旻 曾地剛 朱威霖 彭敏 楊春玲 劉青云 趙永貞 陳秀荔 陳曉漢
摘要：【目的】基于第三代高通量測序技術——單分子實時（SMRT）測序開發凡納濱對蝦微衛星分子標記，為凡納濱對蝦的遺傳育種研究提供基礎資料。【方法】采用SMRT測序對凡納濱對蝦轉錄組進行測序，經Illumina測序糾錯后利用MISA對獲得的轉錄組數據進行分析;以Primer 3.0設計微衛星引物，隨機挑選40對微衛星引物進行PCR擴增驗證，并選用擴增成功且具有多態性的微衛星引物用于不同養殖家系凡納濱對蝦遺傳多態性分析。【結果】凡納濱對蝦轉錄組SMRT測序共獲得51367條非冗余全長轉錄本序列，鑒定出39674條微衛星序列;微衛星的分布密度為0.232 SSR/kb;以二核苷酸重復微衛星序列分布最多，共有22223條（占56.01%）。隨機選取的40對微衛星引物中有26對微衛星引物能成功擴增出特異性條帶;微衛星熒光分型結果顯示，有16個微衛星位點具有多態性，共獲得67個等位基因，平均等位基因數（Na）為4.2個，計算獲得的平均觀測雜合度（Ho）為0.511，平均期望雜合度（He）為0.451，平均多態性信息含量（PIC）為0.489。在16個微衛星位點中，有2個微衛星位點為低度多態性（PIC<0.25），6個微衛星位點為中度多態性（0.25
關鍵詞： 凡納濱對蝦;單分子實時（SMRT）測序;微衛星分子標記;多態性分析
中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0429-08
Development of microsatellite markers of Litopenaeus vannamei and genetic polymorphism analysis of different cultured families
LI Qiang-yong， LI Min， ZENG Di-gang， ZHU Wei-lin， PENG Min， YANG Chun-ling， LIU Qing-yun， ZHAO Yong-zhen， CHEN Xiu-li， CHEN Xiao-han*
（Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy
Aquaculture， Nanning? 530021， China）
Abstract：【Objective】Microsatellite markers of Litopenaeus vannamei based on the third-generation high-throughput sequencing technology， single-molecule real-time （SMRT） sequencing were developed in order to provide basic data for genetic and breeding research of L. vannamei. 【Method】The transcriptome of L. vannamei was sequenced using SMRT. The obtained transcriptome data were corrected by Illumina sequencing， then analyzed by MISA software. The microsatellite primers were designed with Primer 3.0 software， and 40 pairs of microsatellite primers were randomly selected for PCR amplification.? Microsatellite primers with successful amplification and polymorphism were selected for genetic polymorphism analysis of L. vannamei in different breeding families. 【Result】In total， 51367 non-redundant full length transcript sequences and 39674 SSR loci were obtained? by SMRT sequencing of the L. vannamei transcriptome. The distribution density of microsatellites was 0.232 SSR/kb; the dinucleotide repeat microsatellite sequences were the most distribu-ted， with a total of 22223（56.01%）. Of the 40 randomly selected microsatellite primers， 26 pairs of microsatellite primers successfully amplified specific bands. The microsatellite fluorescence phenotyping showed that 16 microsatellite loci were polymorphic. A total of 67 alleles were obtained， and the average number of alleles（Na） was 4.2. The calculated average observed heterozygosity（Ho） was 0.511， the average expected heterozygosity（He） was 0.451，and the average polymorphism information content（PIC） was 0.489. Among the 16 microsatellite loci， 2 loci were low polymorphisms （PIC<0.25）， 6 loci were moderate polymorphisms（0.25
Key words： Litopenaeus vannamei; single molecule real-time sequencing; microsatellite markers; polymorphism analysis
Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204088-1）; National Fishery Science Data Center Observation and Detection Project of Agricultural Basic Long-term Scientific and Technological Work（ZX08S211664）; Science and Technology Plan Project of Guangxi Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau （Guiyumuke 201633015）; Guangxi Key Laboratory of Genetic Breeding and Healthy Breeding Opening Project （17-A-04-04）
0 引言
【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱為南美白對蝦，是世界上養殖最廣泛的甲殼類動物（陳錨等，2008）。凡納濱對蝦具有耐高溫、抗病力強、出肉率高、營養豐富、生長速度快及鹽度適應范圍廣等特點，現已發展成為對蝦養殖的重要對象（王興強等，2004;黃薇等，2014）。1988年，中國科學院海洋研究所首次引進凡納濱對蝦，并于1992年突破人工繁殖難關，之后凡納濱對蝦在全國范圍內廣泛養殖，且各地不斷從國外引進親蝦用于蝦苗生產（王興強等，2004），如今凡納濱對蝦已成為我國對蝦養殖的主導品種。但近年來凡納濱對蝦病害發生頻繁，包括白斑綜合征、桃拉綜合征、傳染性皮下及造血組織壞死病和弧菌病等，給其養殖業造成巨大經濟損失（Lightner，2011）。我國養殖的凡納濱對蝦主要是從國外引進的品種或品系，且多為雜交后代，遺傳背景較復雜，繁育多代后其性狀出現分離，表現為群體生長速度減慢、抗病和抗逆能力減弱等（熊建華等，2011）。因此，急需研發出有效的分子標記技術用于凡納濱對蝦種質資源鑒定及分子標記選育等研究工作。【前人研究進展】微衛星（Microsatellite）又稱簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR），由2～6個核苷酸的串聯重復片段構成，是目前應用較廣泛的分子標記之一（盛巖等，2002;周大顏等，2019）。因其穩定性和可重復性高，且具有特異性和共顯性的特點，現已廣泛應用于動植物的生物遺傳多樣性分析、種質資源鑒定及分子標記等研究領域（孫效文等，2008;張麗穎等，2009;凌士鵬等，2018）。凡納濱對蝦微衛星分子標記在1996年已有報道（Garcia et al.，1996）;而Meehan等（2003）最早實現批量開發微衛星分子標記，通過構建基因組DNA文庫和使用探針篩選的方法共得包含573個微衛星的173條序列。隨著第二代高通量測序技術的發展，已有學者采用高通量測序技術開發凡納濱對蝦微衛星分子標記的研究報道。馬寧和曾地剛（2013）運用454高通量測序技術篩選出588條凡納濱對蝦微衛星序列;Yu等（2014）利用Illumina HiSeq 2000測序技術查找凡納濱對蝦SNP位點;楊銘等（2017）采用Illumina測序技術進行凡納濱對蝦轉錄組測序，結果鑒定獲得14767條微衛星序列;Lu等（2018）通過對凡納濱對蝦進行轉錄組測序，篩選出49個與氨相關的SNPs位點，且進一步鑒定發現有12個SNPs位點與氨耐受性相關;Santos等（2018）通過RNA測序技術（RNA-seq）分析鑒定了與凡納濱對蝦免疫應答及生長性能相關的SNP位點。【本研究切入點】單分子實時（Single-molecule real-time，SMRT）測序是近年來由Pacific Biosciences公司開發的第三代高通量測序技術，為實現全長單分子DNA序列的直接測序提供了平臺（Eid et al.，2009）。SMRT測序長度可達20 kb，能對完整的cDNA分子進行測序，而無需片段化或測序后組裝（Roberts et al.，2013），但至今未見將SMRT測序應用于凡納濱對蝦微衛星分子標記開發的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用SMRT測序對凡納濱對蝦全長轉錄組進行測序分析，從獲得的全長RNA序列中篩選微衛星序列并設計微衛星引物，隨機挑選微衛星引物對不同養殖家系凡納濱對蝦進行遺傳多態性分析，為凡納濱對蝦的遺傳育種研究提供基礎資料。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
供試桂海1號凡納濱對蝦由廣西水產科學研究院南美白對蝦遺傳育種中心提供。取6尾凡納濱對蝦的肌肉、心臟和肝胰腺組織，混合后置于液氮中保存備用。從無特定病原的桂海1號凡納濱對蝦種質庫中隨機取16個不同養殖家系，對蝦平均體長16.0 cm，平均體質量26.8 g/尾，取肌肉組織置于-80 ℃冰箱中保存備用。
1. 2 總RNA提取
按TRIzol LS Reagent試劑盒（Invitrogen，美國）說明從混合的凡納濱對蝦組織中提取總RNA，使用DNase I（Invitrogen，美國）除去基因組DNA。采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美國）測量總RNA的純度（OD260/280）、濃度和吸收峰，并以Agilent 2100 Bioanalyser（美國）測定總RNA質量，RIN（RNA integrity number）>7的總RNA用于構建SMRT測序的cDNA文庫。
1. 3 SMART測序
使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，日本）將10 μg總RNA反轉錄合成cDNA，以BluePippinTM系統（Sage Science，美國）構建5個大小分別為<1 kb、1～2 kb、2～3 kb、3～6 kb和>6 kb的cDNA文庫。按照PacBio的步驟每個cDNA文庫在PacBio RSII平臺上使用C4試劑進行SMART測序;同時使用TruSeq RNA試劑盒（Illumina，美國）構建Illumina凡納濱對蝦cDNA文庫，在HiSeq2500高通量測序儀上進行測序，測序結果用于SMART測序數據的錯誤糾正。
1. 4 微衛星序列鑒定及引物設計
對SMRT測序的原始數據進行質控及Illumina測序糾錯后獲得高質量的全長轉錄本序列，利用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜尋SSR重復基元的區間。MISA參數設置如下：2-6、3-5、4-5、5-5、6-5，復合微衛星分子標記的最大長度100 bp;然后采用Primer 3.0設計微衛星序列的引物。
1. 5 微衛星引物驗證
從批量設計的微衛星引物中隨機挑選40對（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。不同養殖家系對蝦肌肉組織分別采用動物基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA，DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查無降解后使用紫外分光光度計測其濃度，以TE（pH 8.0）稀釋至50 ng/μL，-20 ℃保存備用。
PCR反應體系50.0 μL：基因組DNA模板20 ng，2×Taq MasterMix 25.0 μL ，正、反向引物（10 μmol/L）各2.0 μL，超純水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性1 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環;72 ℃延伸5 min。以2.0%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中150 V下電泳30 min，凝膠成像系統拍照。選取PCR擴增成功的微衛星引物在其正向引物5'端標記FAM熒光基團，并對16尾凡納濱對蝦DNA進行PCR擴增。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海邁浦生物科技有限公司，在ABI 3730測序儀上進行熒光分型。
1. 6 微衛星數據分析
獲得不同養殖家系凡納濱對蝦的微衛星分型數據后，使用PopGen32計算每個微衛星位點的等位基因數（Na）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）及多態信息含量（PIC）。
2 結果與分析
2. 1 凡納濱對蝦微衛星數量及其分布密度
凡納濱對蝦轉錄組SMRT測序共獲得51367條非冗余全長轉錄本序列（GenBank登錄號SRX3267788～ SRX3267801），利用MISA對這些轉錄本序列進行分析，共獲得39674條微衛星序列，分布在29461條轉錄本序列中，包含微衛星的序列占總序列的57.35%。序列拼接總長度為171322994 bp，微衛星的分布密度為0.232 SSR/kb，平均每4.32 kb出現1條微衛星序列。各核苷酸重復類型的凡納濱對蝦微衛星數量差異明顯，其分布密度也存在明顯差異。在所鑒定的39674條凡納濱對蝦微衛星序列（表2）中，二核苷酸重復微衛星序列分布最多，共有22223條（占56.01%）;三核苷酸重復微衛星序列14781條（占37.26%），四核苷酸重復微衛星序列1947條（占4.91%），六核苷酸重復微衛星序列441條（占1.11%）;分布最少的是五核苷酸重復微衛星序列，僅有282條（占0.71%）。
2. 2 凡納濱對蝦微衛星不同重復類型中各核苷酸重復單元的數量與頻率
凡納濱對蝦微衛星二核苷酸重復類型中不同重復單元的數量分布情況如圖1所示，以含AT/TA重復單元的微衛星序列數量最多，其次是CA/TG重復單元和GA/TC重復單元，AC/GT重復單元和AG/CT重復單元的數量差異不明顯。凡納濱對蝦微衛星三核苷酸重復類型中不同重復單元的數量分布情況如圖2所示，以含CTC/GAG重復單元的微衛星序列數量最多，其次是AAT、TTA/TAA、CTG/CAG和AGC/GCT等重復單元。
2. 3 微衛星分子標記驗證結果
根據鑒定出的39674條微衛星序列，利用Pri-mer 3.0設計39367對微衛星引物。為驗證設計的微衛星引物能否通過PCR擴增出微衛星序列，隨機選取40對微衛星引物，在桂海1號凡納濱對蝦DNA混池中進行PCR擴增，結果發現有26對微衛星引物能成功擴增出特異性條帶（圖3），占所選PCR擴增引物數量的65.00%。為進一步驗證微衛星的多態性，以篩選出的26對微衛星引物分別對16個不同養殖家系凡納濱對蝦個體DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物在ABI 3730測序儀上進行熒光分型（圖4），并采用GeneMarker 3.0.0分析分型結果。經微衛星分型后有16個微衛星位點顯示出多態性（表3），多態性位點的等位基因數在2～8，共獲得67個等位基因，平均Na為4.2個，計算獲得的平均Ho為0.511，平均He為0.451，平均PIC為0.489。依據Botstein等（1980）的判斷標準：PIC<0.25代表該位點具有低度多態性，0.25
3 討論
微衛星分子標記對開展水產動物遺傳學研究具有重要意義。為開發凡納濱對蝦微衛星分子標記，本研究采用第三代高通量測序技術——SMRT測序對凡納濱對蝦轉錄組進行測序，結果在獲得51367條非冗余全長轉錄本序列中鑒定出39674條微衛星序列，并設計39367對微衛星引物。Meehan等（2003）通過傳統的構建文庫和探針篩選僅發現573個凡納濱對蝦微衛星，楊銘等（2017）采用高通量測序技術則鑒定獲得14767條凡納濱對蝦微衛星序列。可見，利用高通量測序技術開發微衛星分子標記的優勢在于能大規模發現微衛星序列，極大豐富凡納濱對蝦微衛星分子標記的數量。本研究在分析凡納濱對蝦轉錄組微衛星數量及其分布密度時發現，不同類型重復單元的微衛星數量差異較明顯，其分布密度也存在明顯差異，其中，二核苷酸重復微衛星序列分布最多，與馬寧和曾地剛（2013）、楊銘等（2017）采用高通量測序得到的凡納濱對蝦轉錄組微衛星結果一致。微衛星的分布密度為0.232 SSR/kb，高于楊銘等（2017）采用第二代高通量測序技術獲得的凡納濱對蝦轉錄組微衛星分布密度（0.215 SSR/kb），究其原因可能是本研究測序獲得的RNA序列較長，雖然獲得的非冗余全長轉錄本序列數量（51367條）略少于楊銘等（2017）采用第二代高通量測序技術獲得的非冗余全長轉錄本序列數量（66815條），但相對較長的RNA序列可鑒定出更多微衛星位點。說明采用第三代測序技術開發微衛星分子標記更具優勢。
為驗證設計的微衛星引物，隨機挑選40對微衛星引物對桂海1號凡納濱對蝦DNA混池進行PCR擴增，結果發現有26對微衛星引物擴增成功（占65.00%）。進一步的微衛星分型結果顯示，在26對成功擴增的微衛星引物中有16對在不同養殖家系凡納濱對蝦個體DNA的擴增產物中具有多態性，表明本研究開發獲得的這些微衛星分子標記有相當高的比例可用于凡納濱對蝦遺傳學研究。Na、PIC及遺傳雜合度（H）是檢測種群遺傳多樣性的主要指標。本研究挑選的16個微衛星位點的Na在2～9個，平均為4.2個，符合用于遺傳多樣性評估的微衛星至少具有4個等位基因的標準（Wajid et al.，2014）。Botstein等（1980）認為：PIC<0.25代表該位點具有低度多態性，0.25
H是衡量群體遺傳變異的最適參數，是指群體中某個位點上的雜合子頻率，主要反映群體的遺傳變異程度（Shikano and Taniguchi，2002）;PIC與基因突變率有關（Gyapay et al.，1994），因此，通過H和PIC能反映群體內個體遺傳變異程度，其數值高低與遺傳變異程度呈正相關。本研究中，不同養殖家系凡納濱對蝦的平均Ho為0.511、平均He為0.451，群體的雜合度及遺傳多樣處于中等水平。雜合子缺失現象的產生可能是研究對象數量有限、近親雜交或人為干擾等因素導致稀有堿基缺失所致（Antoro et al.，2006）。Hardy-Weinberg平衡檢驗是評估樣本代表性及其基因分型質量的重要工具（Crane et al.，2004），樣本群體小、近親交配、等位基因突變等均可導致所檢測的種群基因型偏離Hardy-Weinberg平衡（宋煒等，2017）。本研究所分析的16個微衛星多態性位點在16尾不同養殖家系凡納濱對蝦中，有12個微衛星位點滿足Hardy-Weinberg平衡，有4個微衛星點位偏離Hardy-Weinberg平衡，表明不同養殖家系凡納濱對蝦群體遺傳結構尚處于相對穩定狀態。
SMRT測序是近年來新出現的第三代測序技術，是通過觀測單個DNA聚合酶合成過程而實現單分子實時測序的技術。SMRT測序不僅具有測序長度優勢，還不存在GC偏好（Roberts et al.，2013），因此開發的微衛星分子標記在基因組中的分布相對較均勻，而有利于構建遺傳連鎖圖譜。本研究首次利用SMRT測序開發凡納濱對蝦微衛星分子標記，有效增加了凡納濱對蝦的可用微衛星分子標記數量，同時證實采用SMRT測序開發微衛星分子標記是一種高效可行的方法。
4 結論
通過對凡納濱對蝦轉錄組進行SMRT測序、Illumina測序糾錯及MISA分析，共獲得39674條微衛星序列，從設計的39367對微衛星引物中隨機選取40對微衛星引物進行驗證，發現有16對微衛星引物顯示出多態性，說明采用SMRT測序開發獲得的微衛星分子標記有相當高的比例可用于凡納濱對蝦遺傳學研究。即采用SMRT測序開發凡納濱對蝦微衛星分子標記是一種簡單而高效的途徑，有助于開展凡納濱對蝦的遺傳育種研究工作。
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