羅氏沼蝦不同群體世代遺傳多樣性的SSR分析

董丁健 戴習林

摘要：【目的】明確羅氏沼蝦不同群體世代的遺傳多樣性，為其專門化選育系的選育及遺傳改良提供參考依據。【方法】利用25對多態性良好的SSR分子標記對羅氏沼蝦泰國群體、生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體的不同世代進行遺傳多樣性分析，并基于遺傳距離對其進行聚類分析。【結果】泰國群體3個世代的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和多態信息含量（PIC）均呈逐代下降趨勢。生長快專門化選育系群體（SA3和SC2）4個世代的Na、Ne、He和PIC整體上呈下降趨勢，其中，SA3選育系的PIC從0.3827下降至0.2560，SC2選育系的PIC從0.3877下降至0.2557。抗病專門化選育系群體（KB3和KA2）3個世代的Na、Ne、Ho、He和PIC無明顯下降趨勢，KB3選育系的PIC從0.2952下降至0.2845，KA2選育系的PIC從0.3721下降至0.2974。除Ho外，泰國群體各項遺傳參數均高于同期的生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體，抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代的各項遺傳參數也均高于同期的生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代。泰國群體與生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體的遺傳距離較遠，其3個世代獨立聚類成一支;生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體的各世代則聚類成另一支。【結論】生長快專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于純合，而抗病專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于雜合，因此，在羅氏沼蝦專門化品系選育過程中要保證足夠的群體數量防止近親雜交現象發生，或及時引入新的泰國群體對選育群體進行引種復壯。

關鍵詞： 羅氏沼蝦;遺傳多樣性;泰國群體;專門化選育系;SSR分子標記

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0421-08

SSR analysis on genetic diversity in different populations and generations of Macrobrachium rosenbergii

DONG Ding-jian1，2，3， DAI Xi-lin1，2，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306; 2Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources（Shanghai Ocean University），Shanghai? 201306; 3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306）

Abstract：【Objective】This research explored the genetic diversity of different populations at various generations of Macrobrachium rosenbergii，providing a theoretical basis of the breeding and genetic improvement for specialized bree-ding lines. 【Method】The research used 25 pairs of SSR molecular markers with good polymorphism to analyze the gene-tic diversity of different generations of M. rosenbergii of Thai population， fast-growing population and disease-resistant specialized breeding line population. And cluster analysis was conducted based on genetic distance to study the genetic diversity and genetic relationship of different populations and generations of M. rosenbergii. 【Result】The results of the Thai population showed a down trend in number of alleles（Na）， effective number of alleles（Ne）， observed heterozygosity（Ho）， expected heterozygosity（He） and polymorphism information content（PIC） of the three generations from generation to generation. The results of fast-growing specialized breeding lines populations（SA3 and SC2） at four generations? demonstrated downtrend of Na， Ne， He and PIC， PIC of SA3 line dropped from 0.3827 to 0.2560， SC2 decreased from 0.3877 to 0.2557. The results of the specialized disease resistance lines（KB3 ans KA2） did not showed a obviously down trend in Na， Ne， Ho， He and PIC of the three generations from generation to generation.PIC of KB3 decreased from 0.2952 to 0.2845， KA2 decreased from 0.3721 to 0.2974. The genetic parameters of the Thai population were higher than those of the fast-growing specialized breeding lines population and disease resistance breeding lines which been bred at the same time， except Ho. Meanwhile， the genetic parameters of F2 generation of disease resistance breeding lines （KB3 and KA2） were higher than those of F3 generation of fast-growing specialized breeding lines （SA3 and SC2） at the same time. The genetic distance of the Thai population was far from the fast-growing specialized breeding lines population and the disease resistance breeding lines population， and the three generations of the population cluster into one branch. Each generation of the fast-growing specialized breeding lines population and the disease resistance breeding lines population clustered into another branch. 【Conclusion】The breeding direction of fast-growing specialized breeding lines? cause some genes to become homozygous， and the breeding direction of disease resistance breeding lines make some genes tend to be heterozygous. Therefore， in the breeding process of specialized strain of M.rosenbergii， sufficient population number should be ensured to prevent inbreeding， or the introduction of new Thai population in time can make rejuvenation for breeding population.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; genetic diversity; Thai population; specialized breeding line; SSR mole-cular marker

Foundation item： Shanghai Shrimp Industrial Technology System Construction Project（Hunongkechan〔2014〕No.5）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）又稱馬來西亞大蝦，隸屬于節肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）長臂蝦科（Palaemonidae）沼蝦屬（Macrobrachium）（徐洋等，2012;董學洪和陳正興，2015），具有個體大、肉質鮮、生長快、易養殖等優點，但經過多年累代人工繁殖，已出現病害增多、個體小型化、生長速率緩慢、性成熟時間提前及抗病能力下降等現象（劉杰，2012;徐洋等，2012;張瑞祺，2015）。配套系選擇育種是通過小群閉鎖繁育以優化和提純親本系，采用完全雙列雜交進行各選育系雜交試驗，經過配合力和遺傳相關參數測定，選擇雜種優勢水平高的雜交組合，并將具備較好配合力的配套系進行擴繁（武英等，2007;唐首杰等;2016;韓文明等，2019）。微衛星（Microsatellite）又稱簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR），作為第二代分子標記已廣泛應用于分子標記輔助育種及物種遺傳結構分析（趙廣泰等，2010;熊良偉等，2018;Kumari et al.，2018;趙彥花等，2019）。因此，利用SSR分子標記分析選育群體的遺傳關系及其遺傳多樣性，有利于及時調整選育工作，對加速選育群體親本選擇及遺傳改良也具有重要意義。【前人研究進展】2009年，戴習林等提出將目前主要在畜禽業廣泛應用的配套系選育技術應用于羅氏沼蝦選育，現已完成專門化品系組建，并取得一定進展;鄧平平（2012）在此基礎上挑選并組建了6個專門化品系的基礎群體;各基礎群體內部自由交配繁殖，世代選留，最終確定了羅氏沼蝦專門化品系組建路線。此外，鄒衛麗（2012）對篩選出的生長專門化選育系子代進行溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）注射感染試驗，從存活蝦中挑選個體大、活力強、體表無損傷的健康羅氏沼蝦作為抗病選育的基礎群體，初步建立了羅氏沼蝦抗病專門化品系選擇前系;蔣飛等（2014）應用SSR分子標記對羅氏沼蝦5個選擇系F2代的遺傳多樣性和遺傳分化進行研究，結果顯示5個選擇系的多態信息含量（PIC）排序為C（0.4340）

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

羅氏沼蝦樣品均來自上海海洋大學產學研基地上海申漕特種水產開發有限公司，分別是泰國群體（YS）、生長快專門化選育群體（SA3和SC2）和抗病專門化選育群體（KB3和KA2）（表1）。其中，泰國群體包括2015年引進的200尾野生蝦（YS-F0）及閉鎖繼代繁育的子一代（YS-F1）和子二代（YS-F2）;生長快專門化選育群體包括以連續15年閉鎖繁育的391尾上海養殖群體為原始群體的專門化選育系基礎群體（F0）及連續閉鎖選育的F1、F2和F3世代;抗病專門化品系選育群體包括通過溶藻弧菌注射感染生長快專門化選育系F1世代獲得的基礎群體（F0）及連續閉鎖選育的F1和F2世代。采集的肌肉組織保存在無水乙醇中，-80 ℃保存備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 每個樣品選取20 mg肌肉組織，采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取其DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

1. 2. 2 SSR引物合成 采用戴習林等（2017）研發的25對SSR引物（表2）進行遺傳多樣性分析，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴增 參照戴習林等（2012）的方法進行PCR擴增。PCR反應體系10.0 μL：DNA模板（20～50 ng/μL）0.4 μL，MasterMix（0.1 U Taq DNA聚合酶，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，pH 8.3）5.0 μL，正、反向引物（5 μmol/L）各0.3 μL;超純水4.0 μL;加入1滴石蠟油防止蒸發。擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1. 2. 4 PCR擴增產物檢測 PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并置于凝膠成像儀中拍照檢測DNA濃度;同時以8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染顯色后用GelPro32 4.0進行數據采集，根據擴增片段長度和進行等位基因分型。

1. 3 統計分析

使用GelPro32 4.0讀取微衛星目標條帶，利用GREATE、PopGen32和MEGA 3.0等分析Na、有效等位基因數（Ne）、Ho、期望雜合度（He）、PIC及計算群體間的遺傳距離和遺傳相似系數，并以UPGMA法構建系統發育進化樹。采用SPSS 20.0進行試驗數據顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 羅氏沼蝦各群體不同世代的遺傳多樣性比較

泰國群體3個世代的Na、Ne、Ho、He和PIC均隨世代的增加而呈下降趨勢（表3），其中，Na范圍為2.88～3.92、Ne范圍為1.8565～2.5937、Ho范圍為0.3693～0.4919、He范圍為0.4280～0.5641，PIC范圍為0.3630～0.5008。泰國群體YS-F0世代與YS-F1世代的各項遺傳參數無顯著差異（P>0.05，下同），但YS-F0世代與YS-F2世代的Na、Ne、Ho、He和PIC存在顯著差異（P<0.05，下同）。YS-F0世代的近交系數（Fis）最小（0.1131），YS-F1世代的最大（0.2108）。PIC等遺傳參數逐代降低，說明可能已出現近交衰退現象，即泰國群體的小群體閉鎖繼代繁育可能引起近親雜交。

生長快專門化選育系群體（SA3和SC2）4個世代的Na、Ne、He和PIC變化趨勢如表4所示。SA3選育系的Na范圍為1.96～2.88、Ne范圍為1.6015～2.0380、Ho范圍為0.3360～0.3560、He范圍為0.3188～0.4550，PIC范圍為0.2560～0.3827;SA3-F0世代與SA3-F1世代、SA3-F2世代的各遺傳參數無顯著差異，但SA3-F0世代與SA3-F3世代的Na、Ne、He和PIC存在顯著差異。SC2選育系的Na范圍為2.12～2.92、Ne范圍為1.5782～2.0518、Ho范圍為0.2840～0.4553、He范圍為0.3130～0.4674，PIC范圍為0.2557～0.3877;SC2-F0世代與SC2-F1世代的各項遺傳參數無顯著差異，SC2-F0世代與SC2-F2世代的Na、Ho、He和PIC存在顯著差異，SC2-F0世代與SC2-F3世代的Na、Ne、Ho、He和PIC存在顯著差異。在SA3選育系中，SA3-F0世代的Fis最大（0.2223）、SA3-F3世代的最小（-0.1353）;在SC2選育系中，SC2-F2世代的Fis最大（0.1592）、SC2-F1世代的最小（-0.0517），SC2-F0世代和SC2-F1世代的Fis為負值，表明近交程度較輕。

抗病專門化選育系群體（KB3和KA2）3個世代的Na、Ne、Ho、He和PIC無明顯下降趨勢（表5）。KB3選育系的Na范圍為2.04～2.16、Ne范圍為1.6594～1.7322、Ho范圍為0.3050～0.4413、He范圍為0.3580～0.3816、PIC范圍為0.2845～0.2952;KB3-F0世代與KB3-F1世代、KB3-F2世代的各項遺傳參數均無顯著差異。KA2選育系的Na范圍為2.28～2.52、Ne范圍為1.6808～1.9865、Ho范圍為0.2733～0.3959、He范圍為0.3602～0.4541，PIC范圍為0.2974～0.3721;KA2-F0世代與KA2-F1世代、KA2-F2世代的Na、He和PIC無顯著差異，但KA2-F0世代與KA2-F2世代的Ne和Ho存在顯著差異。在KB3選育系中，KB3-F0世代的Fis最大（0.1476）、KB3-F1世代的最小（-0.2289）;在KA2選育系中，KA2-F0世代的Fis最大（0.1132）、KA2-F2世代的最小（-0.2285）。抗病專門化選育系群體（KB3和KA2）F1世代和F2世代的Fis均為負值，表明尚未出現近交現象。

2. 2 羅氏沼蝦不同群體間的遺傳多樣性比較

由于抗病專門化選育系是通過溶藻弧菌注射感染生長快專門化選育系F1世代而獲得基礎群體（F0），因此基于相同年份開展羅氏沼蝦不同群體間的遺傳多樣性比較分析。其中，2014年篩選獲得生長快專門化選育群體F0世代，2015年選育出生長快專門化選育群體的F1世代和抗病專門化選育群體的F0世代及引進泰國群體F0世代，2016年選育出生長快專門化選育群體F2世代及泰國群體和抗病專門化選育群體的F1世代，2017年選育出生長快專門化選育群體的F3世代及泰國群體和抗病專門化選育群體F2世代。由表6可知，除Ho外，泰國群體各項遺傳參數均高于同期的生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體，抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代的各項遺傳參數也均高于同期的生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代。具體表現為：YS-F0世代的Na、Ne和PIC顯著高于生長快專門化選育系（SA3和SC2）F1世代和抗病專門化選育系（KB3和KA2）F0世代，而生長快專門化選育系（SA3和SC2）F1世代與抗病專門化選育系（KB3和KA2）F0世代間的各項遺傳參數均無顯著差異;YS-F2世代的Na和PIC顯著高于生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代和抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代，生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代與抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代間的He和PIC存在顯著差異。

2. 3 不同群體間的親緣關系及聚類分析結果

羅氏沼蝦泰國群體、生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體間的遺傳距離和遺傳相似系數詳見表7。由于抗病專門化選育群體的KB3-F0世代樣本量較少，因此未列入聚類分析中。采用MEGA 3.0對泰國群體、生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體共16個世代進行聚類分析，結果（圖1）顯示，泰國群體遺傳距離與生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體的遺傳距離較遠，3個世代（YS-F0、YS-F1和YS-F2）獨立聚類成一支;抗病KB3選育系和抗病KA2選育系各世代先聚類成一分支，然后與生長快SC2選育系聚類，再與生長快SA3選育系聚類成一支。可見，各專門化選育系不同世代間的遺傳相似性較高，親緣關系較近;而抗病專門化選育群體與泰國群體的遺傳相似性較低，親緣關系較遠。

3 討論

本課題組構建的羅氏沼蝦專門化選育系經多年選育而來，通過選擇性狀優良、生長快、抗病強的個體進行繁殖，與常規選育的苗種相比，在生長速率、個體大小及抗病力存活率方面具有明顯優勢;但通過專門化選育進行選擇也可能會造成群體世代間遺傳多樣性降低。隨著世代選育的進行，目標性狀相關基因得以保留，不利基因則被淘汰，但與目標相關基因的純合在一定程度上會降低位點多樣性，導致群體的適應性下降（張進等，2014）。根據Botstein等（1980）的判斷標準，當PIC>0.50時，為高度多態性;當0.25

羅氏沼蝦泰國群體通過小群體繼代繁育，3個世代的遺傳多樣性呈逐代下降趨勢，YS-F0世代與YS-F2世代的Na、Ne、Ho、He和PIC存在顯著差異，在未進行人工定向選育和保證足夠群體數的情況下，泰國群體出現近交衰退的現象，其種質資源退化。生長快專門化選育群體（SA3和SC2）4個世代的遺傳多樣性整體上呈下降趨勢，其中，SA3選育系的PIC從0.3827下降至0.2560，SA3-F0世代與SA3-F3世代的Na、Ne、He和PIC存在顯著差異;SC2選育系的PIC從0.3877下降至0.2557，SC2-F0世代與SC2-F3世代的Na、Ne、Ho、He和PIC存在顯著差異。由遺傳多樣性指數的變化規律可知，2個生長快專門化選育系SA3和SC2的遺傳多樣性隨選育世代的遞增整體上呈下降趨勢。在SA3選育系中，25718位點的Ne從2.3591下降至1.0689，He從0.5859下降至0.0655，PIC從0.4890下降至0.0620;17493位點的Ne從1.3846下降至1.0000，He從0.2825下降至0，PIC從0.2390下降至0;25288位點的Ne從2.0385下降至1.6838，He從0.5181下降至0.4130，PIC從0.3960下降至0.3240;表明25718和17493位點經選育其基因型已達純合。由此可判斷，25718、17493和25288位點為生長快專門化選育群體SA3選育系的生長關聯性位點;6221、23190、Y16（SUGbp8-103b）和36634位點為生長快專門化選育群體SC2選育系的生長關聯性位點。在抗病專門化選育群體（KB3和KA2）中，3個世代的Na、Ne、Ho、He和PIC無明顯下降趨勢。KB3-F0世代與KB3-F1世代、KB3-F2世代的各項遺傳參數均無顯著差異，KA2-F0世代與KA2-F1世代、KA2-F2世代的Na、He和PIC無顯著差異，但KA2-F0世代與KA2-F2世代的Ne和Ho存在顯著差異。由此可知，生長快專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于純合，而抗病專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于雜合。抗病專門化選育系的選育效果需結合感染存活率和養殖成活率等其他評價標準。

通過人工選育手段對選育群體進行定向選擇，其選育過程通常是在小群體范圍內，一定程度上會發生近交現象，造成群體遺傳多樣性的降低。Fis是衡量群體間基因分化相對程度的重要指標之一。在本研究中，羅氏沼蝦泰國群體、生長快專門化選育群體和抗病專門化選育系群體在選育過程中均出現一定程度的近親雜交現象。在泰國群體中，YS-F1世代的Fis最大（0.2108）、YS-F0世代的最小（0.1131），說明泰國群體在小群繼代繁育中已出現近親雜交。在生長快專門化選育群體中，SA3-F0世代的Fis最大（0.2223）、SA3-F3世代的最小（-0.1353）;SC2-F2世代的Fis最大（0.1592）、SC2-F1世代的最小（-0.0517），且該選育系F0和F1世代的Fis均為負值，表明近親雜交程度較輕。在抗病專門化選育群體中，KB3、KA2選育系F1和F2世代的Fis均為負值，表明抗病專門化選育系隨著世代的進行不會出現近親雜交。因此，在羅氏沼蝦選育過程中要保證足夠的群體數量防止近親雜交現象發生，而導致選育群體遺傳多樣性下降及種質資源退化，或及時引入新的泰國群體對選育群體進行引種復壯（史建華等，2001）。

不同的選育目標和選育手段會造成選育群體遺傳多樣性存在明顯差異。羅氏沼蝦泰國群體經小群體的保種選留，其遺傳多樣性仍然高于以地方群體為基礎的專門化選育群體，與張進等（2014）的研究結果一致。本研究結果表明，除Ho外，泰國群體各項遺傳參數均高于同期的生長快專門化選育群體和抗病專門化選育群體，抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代的各項遺傳參數也均高于同期的生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代。由于羅氏沼蝦泰國群體尚未進行定向選育，仍保持著較高的雜合度和較多的生長形狀，而具有豐富的基因型及更高的遺傳潛力，與馮建彬等（2010）、夏建海等（2014）的研究結果一致。抗病專門化選育系（KB3和KA2）F2世代的He（0.3580和0.3602）顯著高于同期生長快專門化選育系（SA3和SC2）F3世代的He（0.3188和0.3131），與朱其建等（2013）的研究結論一致，即抗病較強的群體遺傳多樣性明顯高于抗病力低的群體，表明抗病專門化選育系在選育過程中需要保證一定的基因雜合度。因此，抗病專門化選育系的選育目標應保證群體具有穩定遺傳的雜合基因。

4 結論

羅氏沼蝦泰國群體和抗病專門化選育群體具有較豐富的遺傳多樣性，生長快專門化選育群體的遺傳多樣性較低。生長快專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于純合，而抗病專門化選育系的選育方向會使某些基因趨于雜合，因此，在羅氏沼蝦專門化品系選育過程中要保證足夠的群體數量防止近親雜交現象發生，或及時引入新的泰國群體對選育群體進行引種復壯。

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