NaCl脅迫對黑小麥根系DNA損傷的影響

陳瑞 唐秀梅 張琪 楊蓉 黃蕾蕾 任晴雯 朱森林 劉鵬

摘要：【目的】探究氯化鈉（NaCl）脅迫對黑小麥根系DNA損傷的影響，為尋求減輕環境因子對植物DNA損傷的方法及培育耐鹽黑小麥品種提供參考。【方法】以黑小麥品種漯珍1號為材料，采用5個NaCl質量濃度（0、3、6、9、12和15 g/L）溶液處理黑小麥幼苗根系，通過彗星電泳試驗，利用CASP 1.2.2分析代表黑小麥幼苗根系DNA損傷的尾部DNA含量、尾長和尾矩等指標。【結果】隨著NaCl質量濃度的增加，彗星頭部漸小，拖尾漸長，黑小麥根系DNA損傷片斷的遷移水平逐步上升。尾部DNA含量、尾長和尾矩均隨著NaCl質量濃度的增加呈升高趨勢，在15 g/L處理下，三者的升幅分別達67.56%、139.40%和39.88%。隨著NaCl質量濃度的增加，Olive尾矩（OTM）均有提高，但增長率慢慢下降，12～15 g/L的增長率降至5.42%，說明黑小麥具有一定的耐鹽性。【結論】NaCl脅迫會引起黑小麥根系DNA損傷，且受損程度隨著NaCl質量濃度的增加而愈發嚴重，但黑小麥對NaCl脅迫仍存在一定抗性。

關鍵詞： 黑小麥;NaCl脅迫;彗星電泳;根系DNA損傷

中圖分類號： S512.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0299-06

Effects of NaCl stress on root DNA damage of black

kernel wheat

CHEN Rui1，2， TANG Xiu-mei3， ZHANG Qi1，2， YANG Rong1，2， HUANG Lei-lei1，2，

REN Qing-wen1，2， ZHU Sen-lin4， LIU Peng1，2*

（1Key Laboratory of Botany， Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang? 321004， China; 2Research Institute of Ecology， Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang? 321004， China; 3Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 4Agricultural and Bioengineering Institute，Jinhua Polytechnic， Jinhua， Zhejiang? 321007， China）

Abstract：【Objective】Effects of? sodium chloride（NaCl） stress on root DNA damage of black kernel wheat were explored in order to provide an important theoretical reference for finding a way to reduce the damage of environmental factors to plant DNA and salt tolerant black kernel wheat varieties breeding. 【Method】Using black kernel wheat （Luozhen No.1）as the materials，five NaCl mass concentrations（0，3，6，9，12 and 15 g/L） were set for black kernel wheat root treatment. This research was studied by comet assay. Indexes representing root DNA damage of black kernel wheat，such as tail DNA content，tail length and tail moment，were analyzed using CASP software. 【Result】The comet head was gradually becoming small and trailing gradually extended as NaCl concentration aggravated. Furthermore，the migration level of DNA damage fragments in the root increased. Tail DNA content，tail length and tail moment increased with the augment of NaCl concentration. Under 15 g/L treatment，the increases of tail DNA content，tail length and tail moment each were 67.56%，139.40% and 39.88%. With the increase of NaCl mass concentration，Olive tail moment（OTM）values increased but the increasing rate slowly declined，even fell to 5.42% between 12 g/L and 15 g/L concentration，indicating that black kernel wheat had certain salt tolerance. 【Conclusion】NaCl stress causes root DNA damage of black kernel wheat，and DNA damage enhances as the NaCl mass concentration increases， but black kernel wheat still has certain resistance to NaCl stress.

Key words： black kernel wheat; NaCl stress; comet assay; root DNA damage

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41571049）; Zhejiang Public Welfare Technology Application Research Project（2015C32127）

0 引言

【研究意義】小麥（Triticum aestivum L.）為禾本科小麥屬一年生草本植物，其中黑小麥是獨具特色的一類品種，其籽粒呈藍色、紫色、深褐色或接近于黑色。黑小麥的氨基酸、粗蛋白、可溶性蛋白及膳食纖維等營養價值較高，各種礦質元素和維生素含量極豐富，是較突出的黑色食品資源之一（Sun et al.，2011），具有補鈣、防癌、益壽、滋補的功效。但目前我國鹽漬土分布十分廣泛，土壤鹽漬化嚴重危害農業生產和生態環境，鹽脅迫對黑小麥的質量和產量造成嚴重威脅。因此，探索鹽脅迫對黑小麥根系DNA損傷的影響，對于尋求減輕環境因子對植物DNA損傷的方法及培育耐鹽黑小麥品種具有重要意義。【前人研究進展】國內外已有較多關于在逆境脅迫下植物DNA損傷的研究，主要涉及黃芪（姜志艷等，2013）、三七（朱美霖等，2014）和擬南芥（宋婕，2017）等植物。有研究表明，紫外輻射會引起煙草（Nicotiana tabacum L.）DNA受損（賈敬芬，2010）。在銅、鎘等重金屬脅迫下，隨脅迫濃度升高植物DNA損傷逐漸嚴重（茍本富，2011;魏志琴等，2013）。目前與鹽脅迫對植物影響相關的報道主要集中于耐鹽性、染色體及基因表達、抗氧化損傷等方面。陳桂平等（2003）采用cDNA-AFLP技術，闡明小麥耐鹽突變體在鹽脅迫下基因表達的過程與差異。陳小燕等（2003）研究表明，氯化鈉（NaCl）脅迫會引起染色體黏連、斷裂及不均等分離等問題。楊飛等（2013）研究發現，NaCl脅迫會導致菘藍（Isatis indigotica Fortune）DNA甲基化模式改變，部分DNA發生超甲基化和去甲基化。Zou等（2015）探明了殼寡糖（COS）可增強抗氧化活性，從而保護小麥免受鹽脅迫的損害。【本研究切入點】目前，鮮見從分子水平探究NaCl脅迫對黑小麥DNA損傷情況的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過單細胞凝膠電泳試驗，探討黑小麥幼苗根系DNA在不同NaCl質量濃度處理下的損傷程度，并拍攝彗星圖像，檢測DNA損傷遷移部分的遷移長度、尾部DNA含量、尾矩、尾長及Olive尾矩，綜合分析NaCl脅迫下黑小麥根系DNA損傷情況，為尋求減輕環境因子對植物DNA損傷的方法及培育耐鹽黑小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試黑小麥品種為漯珍1號，采自山東省泰安市優質黑小麥專業種植基地。供試土壤為浙江師范大學附近的農區酸性紅壤，經檢測土壤基本性狀為：pH 5.97、有機質18.1 g/kg、陽離子代換量3.92 cmol/kg、水溶性鹽總量2.66 g/kg、全氮0.54 mg/kg、水解氮22.90 g/kg、速效磷60.60 mg/kg及速效鉀147.80 mg/kg。

1. 2 試驗方法

分別挑選大小一致、顆粒飽滿的黑小麥種子，經0.1%升汞溶液表面消毒后放入蒸餾水中，吸漲4 h后，播于鋪有2層濾紙的培養皿（直徑10 cm）內，每皿100粒。待種子萌發后，挑取發育健壯、長勢一致的幼苗各15株，分別植于5 kg桶裝土內，每桶施入基肥（尿素2.14 g、磷酸二氫鈣1.17 g、氯化鉀1.58 g、鉬酸銨0.02 g、四硼酸鈉0.04 g），用NaCl溶液處理土壤，共設5個NaCl質量濃度處理組，分別為T0（0 g/L，對照）、T1（3 g/L）、T2（6 g/L）、T3（9 g/L）、T4（12 g/L）和T5（15 g/L），每處理重復3次。在黑小麥整個生長時期均以蒸餾水灌溉。

1. 3 測定項目及方法

1. 3. 1 機械法分離細胞核 參考林愛軍等（2005）機械分離法，取各NaCl質量濃度溶液處理過的幼苗根系放于預冷的玻璃培養皿中，并加入一定體積的磷酸緩沖液（PBS），用刀片在該緩沖液中輕輕將小麥根系豎直切開，使根系細胞核進入緩沖液，獲得根系細胞核的懸浮液。為避免光線對試驗結果的影響，所有操作均在紅光燈下進行。

1. 3. 2 凝膠制備 參照郭煒（2008）單細胞凝膠電泳法，采用“三明治”瓊脂糖凝膠進行電泳。將載玻片浸入PBS配制的1%正常熔點瓊脂糖中，迅速取出，加蓋玻片，4 ℃凝固10 min或室溫凝固;取細胞核懸液50 μL和l%低熔點瓊脂糖50 μL混合均勻，滴加到第一層凝膠上，加蓋玻片，4 ℃凝固10 min;揭去蓋玻片，將100 μL預熱的0.5%岫滴加到載玻片上，加蓋玻片。

1. 3. 3 裂解和電泳 參照張來軍等（2010）的方法，將制備好的瓊脂糖凝膠載玻片浸入堿性裂解液（2.5 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，10 mol/L HCl，1%肌氨酸鈉，pH 10）中裂解0.5～3.0 h，之后用清水進行沖洗并放入水平電泳槽中，加入新配制的預冷堿性電泳液（0.00l mol/L Na2EDTA，0.3 mol/L NaOH，pH>13），在電壓26 V、電流300 mA下電泳15～40 min。

1. 3. 4 中和及染色 電泳結束后，用0.4 mol/L Tris-HCl反復沖洗3次，每次5 min，濾紙吸干后在每張載玻片上加入30 μL溴化乙錠進行染色（Singh et al.，2009）。

1. 4 統計分析

運用SPSS 20.0中的單因素方差分析法（One-way ANOVA）和Duncans新復極差法進行差異顯著性分析，采用Origin 8.5制圖。彗星觀察及數據分析在激發光546 nm、濾光片590 nm的條件下，用熒光顯微鏡觀察（該條件下和溴化乙錠結合的DNA發出紅色熒光），以CCD拍照獲取彗星圖像，并用CASP 1.2.2分析獲取單個細胞核彗星試驗的相關數據。

2 結果與分析

2. 1 NaCl脅迫對黑小麥根系DNA損傷的情況

黑小麥經不同質量濃度NaCl溶液脅迫后，通過電泳試驗獲得的彗星狀圖像（圖1）顯示，在相同電泳條件下，T0組細胞無拖尾現象，T1組拖尾并不明顯。隨著NaCl質量濃度的增加，拖尾漸長，遷移水平逐漸上升，揭示高質量濃度的NaCl脅迫對黑小麥根系細胞核DNA損傷有明顯影響，彗星尾長均高于對照T0組，細胞核受損越來越嚴重，尤其是在15 g/L NaCl脅迫下拖尾現象最顯著，說明高質量濃度NaCl脅迫會引起黑小麥根系DNA的破壞。

2. 2 彗星電泳圖像各項指標分析結果

由圖2可知，T0和T1組尾部DNA各項指標無顯著差異（P>0.05，下同），說明低質量濃度NaCl脅迫下，黑小麥根系DNA幾乎沒有受損。但NaCl質量濃度超過6 g/L時，尾部DNA含量、尾長和尾矩等指標均明顯上升，于15 g/L處理（T5）下達最大值，分別較T0組增加67.56%、139.40%和39.88%。其中尾長的升高趨勢最明顯，T1、T2、T3、T4和T5組尾長分別較T0組增加3.17%、29.85%、53.11%、122.83%和139.40%，且T2～T5組與T0組差異顯著（P<0.05，下同）。表明NaCl質量濃度增加會加重黑小麥根系DNA的損害，即NaCl質量濃度與DNA損傷存在明顯的劑量—效應關系。綜上所述，低質量濃度NaCl脅迫下，黑小麥根系DNA損傷不明顯，但隨著NaCl質量濃度的增加，根系DNA的損傷狀況不斷加劇。

2. 3 DNA損傷程度代表值Olive尾矩（OTM）的變化曲線

OTM表示尾部DNA含量占總DNA含量百分比與頭、尾部中心間距的乘積（何晶等，2008），可同時反映彗星拖尾中DNA含量和彗尾的形狀特征，是DNA損傷定量化的常用指標（Lovell and Omori，2008）。從圖3可看出，隨著NaCl質量濃度的增加，黑小麥DNA的OTM不斷增大，在15 g/L NaCl溶液處理（T5組）下達最大值，較T0組增加39.82%。當NaCl質量濃度小于3 g/L（T1組）時，根尖細胞中DNA損傷的OTM較小，屬于輕度損傷范圍，T1組的OTM增幅也不明顯，表明幾乎無DNA損害。相較于T0組，T1、T2、T3、T4和T5組的OTM分別提高1.77%、11.93%、21.28%、32.64%和39.82%。但其增長率波動下降，分別為1.77%、9.99%、8.35%、9.36%和5.42%。可見，OTM增長速度整體上較平緩，其最高增長率為9.99%（介于T1～T2），而在T4～T5的增長率降到5.42%，證明黑小麥具有一定的耐鹽性。

3 討論

斷鏈DNA和堿易變性DNA片段在堿性溶液（pH>13）中會分解為單鏈向陽極移動，其遷移速度較未斷裂DNA快，從而產生拖尾，形成彗星狀圖像（沈丹艷等，2013）。且DNA損害程度越大，遷移DNA量越多，遷移距離便越長，拖尾現象越明顯（Collins，2017）。因此，彗星圖像中的拖尾長度可評定細胞DNA損傷程度，確定外界作用因素與DNA損傷間的劑量—效應關系（Meng and Zhang，1998;宋超等，2013）。本研究結果顯示，T1、T2、T3、T4和T5組與T0組相比，尾長分別增加3.17%、29.85%、53.11%、122.83%和139.40%，OTM分別提高1.77%、11.93%、21.28%、32.64%和39.82%。在低NaCl脅迫水平下，黑小麥根系DNA拖尾現象并不明晰，OTM較小，與張建新等（2017）研究發現的低濃度錳脅迫處理后臭牡丹（Clerodendrum bungei Sterd.）根系DNA拖尾不清晰，DNA損傷較弱的結論相似;姜志艷等（2013）對鋅脅迫下黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.]的DNA損傷探索中也呈現出相似結果。這可能是由于黑小麥具有一定的DNA自身修復能力，Rowan等（2010）也曾指出RecA介導同源重組DNA修復機制是最具典型性的損傷修復系統。從彗星圖像中可看出，隨著NaCl質量濃度的增加，NaCl脅迫顯著引起黑小麥根系DNA遷移，該趨勢與沈丹艷等（2013）對鋁脅迫下蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench.）根系DNA損傷的拖尾長度變化，公新忠等（2010）對鈾脅迫下大豆[Glycine max （Linn.） Merr.]幼莖尾長變化探究均有較好的相關性。由此可知，低質量濃度NaCl脅迫處于黑小麥DNA損傷修復能力的承受范圍之內，植株在一定程度上可適應NaCl脅迫環境，但高質量濃度（12～15 g/L）NaCl脅迫已超出其自身修復限度，從而導致黑小麥根系DNA明顯遷移，拖尾長度變長，尾部DNA含量增加且OTM變大。

植物在外界非生物脅迫下，DNA會引起不同程度的損傷變異，甚至斷裂（Waterman et al.，2006）。本研究結果表明，隨著NaCl質量濃度的增加，黑小麥尾部DNA含量、尾長和尾矩均逐漸增大，與郭煒（2008）進行的紫外輻照脅迫會引起6種植物材料[柴胡（Bupleurm scorzonerifolium Willd.）、鹽芥（The-llungiella salsuginea）、擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）、中間堰麥草（Thinopyrum intermedium （Hest）Nevski）、小麥（Triticum aestivum L.）和簇毛麥（Haynaldia villosa L. Schur.）]DNA損傷的研究結果相同。在本研究中顯現出的拖尾長度及尾矩變化趨勢，與高曦等（2014）對菲脅迫下蠶豆（Vicia faba L.）根尖細胞DNA損傷的探討有較好的一致性。當NaCl質量濃度增加時，OTM逐步增長，黑小麥根系DNA的損傷程度逐漸加強，與魏志琴等（2013）探索銅脅迫下擬南芥根細胞DNA損傷的OTM變化規律相似。由此可知，尾部DNA含量、尾長、尾矩、OTM與NaCl質量濃度均具有明顯的正相關性，高質量濃度NaCl脅迫對黑小麥根系DNA損傷影響顯著大于低質量濃度NaCl脅迫，其間存在劑量—效應關系。

已有研究表明，NaCl脅迫下的丙二醛含量（王文銀等，2017）、質膜NADPH氧化酶活性、抗氧化酶活性（周萬海等，2015）等指標均可用于檢測小麥對鹽害的敏感度，但相關研究主要集中于植物生長發育的外在表現、內部結構、抗氧化酶系統及根系生態效應等方面，很少涉及分子層面。本研究從DNA分子水平出發，運用現代分子生物學技術綜合分析，采用彗星電泳方法檢測黑小麥在NaCl脅迫下的損傷程度并進行耐鹽性鑒定，發現低質量濃度NaCl脅迫處理后的根系DNA拖尾不清晰，且OTM雖隨著NaCl質量濃度的增加逐漸加大，但其增長率呈波動下降，6、9、12和15 g/L NaCl脅迫下，分別為9.99%、8.35%、9.36%和5.42%。說明其增長速度均較平緩，植株表現出一定的耐鹽性，在張瑞富等（2007）的研究中也得到相似結論。綜上所述，在一定質量濃度范圍的NaCl脅迫下，黑小麥的OTM、尾部DNA含量和尾矩均呈波動下降趨勢，表明其具有較好的耐鹽性。

土壤鹽漬化嚴重危害農業生態環境，降低土地資源利用率，進而影響農作物的產量和質量，造成巨大的經濟損失。鹽漬土的改良利用：一方面可將土壤鹽含量降低到作物能適應的范圍內，另一方面通過強化作物的耐鹽能力，而適應土壤鹽漬環境。在黑小麥的規模化生產中，可先選擇對鹽脅迫有一定適應能力的抗性品種，并重點考慮對作物生長具有顯著影響的NaCl成分，結合黑小麥對其耐受程度，在鹽漬化的種植土壤中，控制NaCl質量濃度低于3 g/L，以期獲得最佳栽培效果。

4 結論

NaCl脅迫會引起黑小麥根系DNA損傷，且受損程度隨著NaCl質量濃度的增加而愈發嚴重，但黑小麥對NaCl脅迫仍存在一定抗性。

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