一株木欖內生真菌菌株的分類鑒定及其對鐵皮石斛生長和多糖積累的影響

藍桃菊 張艷 謝玲 陳艷露 張雯龍 黃昌艷

摘要：【目的】從紅樹植物內生真菌中篩選能促進鐵皮石斛（Dendrobium officinale）生長的內生真菌菌株，并對其進行分類鑒定，為下一步開展鐵皮石斛乃至其他特色作物專用菌劑（肥）開發利用提供理論依據。【方法】以北部灣紅樹植物內生真菌為研究對象，通過平皿和盆栽試驗篩選對鐵皮石斛具有優良促生作用的菌株，并綜合形態學特征觀察及ITS序列和18S rDNA序列分析結果對表現突出的促生菌株進行分類鑒定。【結果】從32株內生真菌中篩選獲得對鐵皮石斛具有良好促生效果的深色有隔內生真菌（DSE）菌株1株，該菌株分離自木欖（Bruguiera gymnorrhiza）莖，編號HS40;通過再分離及顯微觀察，發現菌株HS40可定殖于鐵皮石斛根部并產生DSE的典型特征——微菌核和菌絲。盆栽鐵皮石斛苗接種菌株HS40 6個月后，其株高、分蘗數、總鮮重、總干重和莖干多糖含量分別較對照增加21.7%、375.0%、94.7%、57.6%和15.8%，其中，株高、總鮮重、總干重和莖干多糖含量與對照相比達極顯著差異水平（P<0.01），分蘗數達顯著差異水平（P<0.05）。綜合形態觀察和序列分析結果，將菌株HS40鑒定為球腔菌科（Mycosphaerellaceae）的Zasmidium citri-griseum。【結論】菌株HS40可顯著促進鐵皮石斛的生長并提高其莖干多糖含量，有望用于開發鐵皮石斛專用菌劑（肥）。

關鍵詞： 鐵皮石斛;深色有隔內生真菌;Zasmidium citri-griseum;促生;多糖含量

中圖分類號： S182;Q939.96? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0275-08

Identification of an endophytic fungus isolated from Bruguiera gymnorrhiza and its? effects on the growth and polysaccharide accumulation of Dendrobium officinale

LAN Tao-ju1， ZHANG Yan1， XIE Ling 1*， CHEN Yan-lu1， ZHANG Wen-long 1，

HUANG Chang-yan2

（1Microbiology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 2Flowers Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】To select and identify endophytic fungus isolates from mangrove which could promote the growth of Dendrobium officinale， aiming to provide functional isolates and theoretical basis for the development of microbial inoculum or bacterial manure for D. officinale and even other special crops. 【Method】The endophytic fungi，isolated from mangrove plants in Beibu Gulf，were inoculated to D. officinale，growing both in Petri dishes and plastic cups，to evaluate their growth promoting capacity，and the fungi with good performance were identified based on morphological characteristics and sequences analysis of ITS and 18S rDNA gene. 【Result】An isolate of dark septate endophytes（DSE） having sound promotion effects on D. officinale，with the number of HS40 and being isolated from stem of D. officinale， was screened out from 32 endophytic fungi. The results showed that，HS40 could colonize in the roots of D. officinale，and the microsclerotium，typical characteristic of DSE，could be found in the root re-isolation and microexamination. Compared to that of non-inoculated plants（CK），the average plant height，number of new buds，total fresh weight，total dry weight and polysaccharide content in stems of the plants inoculated by HS40 after growing in the plastic cups for 6 months increased significantly by 21.7%，375.0%，94.7%，57.6% and 15.8%，respectively. The difference compared to control of plant height，total fresh weight，total dry weight and polysaccharide content reached extremely significant level（P<0.01）， and that of number of new buds reached significant level（P<0.05）. Based on morphological observation and sequence analysis mentioned above，isolate HS40 was identified as Zasmidium citri-griseum，which belonged to the family of Mycosphaerellaceae. 【Conclusion】Isolate HS40 can significantly promote D. officinale growth and improve polysaccharide content in its stems，thus，it might be further used in the production of microbial inoculum or bacterial manure for D. officinale.

Key words： Dendrobium officinale;dark septate endophyte;Zasmidium citri-griseum;growth promotion;polysaccharide content

Foundation item： Guangxi Science and Technology Development Fund（2015GXNSFBA139083）; Science and Technology Developmen Fund of Guangxi Accademy of Agricultural Sciences（GNK2017JZ43，GNK2018JZ05）; Basic Research Project of Guangxi Accademy of Agricultural Sciences（2015YT80）

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）屬蘭科石斛屬植物，被譽為“中華九大仙草”之首（方香香和張壽文，2014）。自然條件下鐵皮石斛種子需與真菌共生才能正常萌發和生長發育，繁殖率較低，生長緩慢，加上生境遭受破壞和過度采集，鐵皮石斛野生資源極度稀缺（李昊，2013）。因此，廣泛收集、篩選鐵皮石斛優良促生真菌并深入開展互作研究，有利于實現鐵皮石斛的人工生態高效栽培，對保護鐵皮石斛野生資源、促進鐵皮石斛藥材資源的可持續利用具有重要意義。我國擁有遼闊的海域，紅樹林（Mangrove）資源十分豐富，紅樹林分布面積約34472 ha，其中以廣東省紅樹林面積最大，其次是廣西（但新球等，2016）。加強對紅樹林內生真菌的研究既可豐富我國已知真菌資源寶庫，又可為內生菌株在鐵皮石斛乃至其他特色作物生產上的開發利用提供資源保障。【前人研究進展】紅樹林是熱帶、亞熱帶海岸潮間帶特有的木本植物群落（張嬈挺和林鵬，1984）。其生長環境獨特，蘊藏著豐富的真菌資源。據報道，紅樹林真菌是海洋第二大真菌生態群（Xing and Guo，2011）。自20世紀末，Kohlmeyer和Volkmann-Kohlmeyer（1991）首次從澳大利亞紅樹林中分離到內生真菌以來，有關紅樹林內生真菌的研究主要集中在內生真菌多樣性及其代謝產物方面（劉愛榮等，2007;高劍等，2013;徐靜，2015;金黎明等，2017;周婧等，2019）。目前被分離鑒定的紅樹林內生真菌已超過280種（徐靜，2015）。紅樹林內生真菌具有宿主專一性或廣譜性的特點。Ananda和Sridhar（2002）從印度4種紅樹林植物中分離獲得30種內生真菌，但未見同一種內生真菌同時分離自這4種植物;而周婧等（2019）報道，鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢屬（Cladosporium）等10個屬的內生真菌為紅樹、紅海欖和紅茄苳等3種紅樹植物的共同屬。王桂文和李海鷹（2003）對4種紅樹植物根部叢枝菌進行研究，發現紅樹植物根中除有叢枝菌定殖外，還有一種具有很高定殖率的深色有隔真菌。相關研究表明，紅樹內生真菌可產生大量結構新穎且具有較強生理活性的化合物，主要包括生物堿類、內酯類、香豆素類和萜類等（高劍等，2013;徐靜，2015;金黎明等，2017）。這些內生真菌代謝產物具有抗腫瘤活性，或具有抑制病原微生物、α-葡聚糖苷酶、乙酰膽堿酯酶（AchE）活性及殺滅線蟲等不同功能（Klaiklay et al.，2012;李寧等，2013;Huang et al.，2016）。此外，還有少量關于紅樹植物內生真菌菌株生防功能研究的報道。彭琛（2005）研究發現，來自5種紅樹植物的141株內生真菌中有42株內生真菌至少對一種指示菌有抑制作用;楊定祥（2018）研究發現，分離自桐花根內的TH-T20菌株對辣椒疫霉防治效果較好且穩定。【本研究切入點】至今未見關于紅樹植物內生真菌對鐵皮石斛等特色作物促生的研究報道。本課題組前期從廣西沿海具有代表性的紅樹植物中分離獲得41株內生真菌菌株（張艷等，2017）。基于部分紅樹林內生真菌宿主具有廣譜性的特點，推測我國紅樹植物中可能存在可促進鐵皮石斛生長的內生真菌菌株。【擬解決的關鍵問題】從紅樹植物內生真菌中篩選對鐵皮石斛具有顯著促生作用的菌株，并對其進行分類鑒定，以期為相關菌株在鐵皮石斛乃至其他優勢特色作物生產上的開發利用提供資源保障和技術參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試內生真菌 從北部灣山口國家紅樹林生態自然保護區、北侖河口紅樹林保護區等地木欖（Bruguiera gymnorrhiza）、 紅海欖（Rhizophora stylosa）、 秋茄（Kandelia obovata）、桐花樹（Aegiceras corniculatum）和白骨壤（Avicennia marina）等優勢紅樹植物中分離獲得。

1. 1. 2 供試鐵皮石斛組培苗 由廣西農業科學院花卉研究所提供，編號為784。

1. 1. 3 供試培養基 菌株活化、純化培養分別使用麥芽汁培養基（CMMY，麥芽提取物10.0 g/L，酵母浸膏2.0 g/L，玉米粉瓊脂8.5 g/L，瓊脂7.5 g/L）和馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA，馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂15.0 g/L）;菌株液體培養使用馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB，馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L）;鐵皮石斛苗平皿培養、真菌菌絲培養使用燕麥培養基（OMA，瓊脂14.0 g/L，燕麥粉10.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaNO3 1.0 g/L）;鐵皮石斛苗根部內生真菌再分離使用1/2玉米粉培養基（1/2CM，玉米粉瓊脂8.5 g/L，瓊脂7.5 g/L）。

1. 1. 4 主要試劑和儀器設備 PCR試劑盒（2×Easy Taq PCR SuperMix）購自北京全式金生物技術有限公司;引物ITS1/ITS4和NS1/NS4的合成及DNA測序委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。MJX-250B霉菌培養箱購自天津市泰斯特儀器有限公司;DYY-8C型電泳儀、WD-9413C凝膠成像分析儀購自北京六一生物科技有限公司;東勝-ETC811基因擴增儀購自北京東勝創新生物科技有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 鐵皮石斛促生菌株篩選

1. 2. 1. 1 平皿試驗 菌株活化后，用滅菌手術刀將菌落均勻切成小塊，按每皿3塊接種于OMA培養基上，繼續置于霉菌培養箱內培養14 d后備用。在超凈工作臺上，選取莖粗和株高基本一致的鐵皮石斛無菌組培苗移栽至菌落上，每個培養皿移栽3株。每處理接種4皿，設4個重復，以未接種菌株而直接移栽鐵皮石斛苗為對照處理。將移栽有鐵皮石斛苗的培養皿放入組培瓶中，置于培養箱中進行共培養。培養條件：溫度26 ℃，光照強度180 μmol/（m2·s2），光照時間16 h/d。考慮不同菌株菌絲生長速度存在明顯差異，相關菌株被分成6批進行平皿培養。各批次均在培養60 d時測量株高、莖徑、根長、鮮重和干重等指標，并觀察內生真菌定殖情況。此外，參照Narisawa等（1998）的方法，取每個重復植株根部表面消毒后對內生真菌進行再分離，以確認分離菌株是否為接種菌株。

1. 2. 1. 2 盆栽試驗 選取平皿試驗效果較好的菌株進行盆栽試驗。取長勢一致的鐵皮石斛組培苗，移栽至以消毒水草為培養基質的塑料杯中（杯口直徑為5 cm），5株/杯，種植30 d時開始施用菌液。每杯施用菌液20 mL，間隔15 d再施用1次，共施用3次。每處理5杯，設4個重復，另以不施菌液為對照處理。菌液制備方法：將1.2.1.1所描述的菌塊接種于PDB培養基后放置于溫度26 ℃ 、轉速150 r/min的搖床中進行培養，14 d左右過濾菌液收集菌絲團，將其粉碎后配制成濃度為5×105 CFU/mL的菌液。第1次施菌液后180 d取樣，觀察菌株定殖情況，測量不同處理鐵皮石斛苗相關生長指標。

1. 2. 2 優良促生菌株對鐵皮石斛多糖積累的影響

綜合平皿培養和盆栽試驗結果，并參考陳毓荃（2002）的方法，對綜合表現良好的鐵皮石斛苗進行莖干多糖含量測定。

1. 2. 3 優良促生菌株分類鑒定

1. 2. 3. 1 菌株形態學觀察 參考謝玲等（2016）的方法，將菌株接種于CMMY培養基上，培養2周后觀察菌落形態特征。同時，將滅菌蓋玻片置于1.5%水瓊脂培養基上，蓋玻片中央放置一塊0.5 cm×0.5 cm的OMA培養基，同時將菌株接種于OMA培養基上并于28 ℃下培養2周;以工作波長為365 nm的黑光燈間歇照射（12 h黑光燈照射，12 h黑暗），繼續培養1個月左右，誘導其產孢后取出蓋玻片用乳酸酚棉蘭染色，在光學顯微鏡下觀察菌株產孢結構及分生孢子形態。

1. 2. 3. 2 菌株分子鑒定 挑取CMMY培養基上的菌絲直接用于PCR擴增，ITS序列PCR擴增采用通用引物ITS1/ITS4;18S rDNA序列PCR擴增采用引物NS1/NS4/（White et al.，1990）。PCR反應體系50.0 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix 25.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL（挑取少量菌絲），用ddH2O定容至50.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性2 min;94 ℃ 40 s，50 ℃ 1 min，68 ℃ 4 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物純化后委托北京六合華大基因科技有限公司測序。

在GenBank中對獲得的基因序列進行同源比對，下載最相似序列，使用MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育進化樹，并通過1000次Bootstrap循環檢驗系統發育進化樹的可靠性（Jumpponen and Trappe，1998;Hou and Guo，2009;謝玲等，2016）。

1. 3 統計分析

采用 Excel 2010對試驗數據進行整理統計，并以DPS 7.05進行方差分析。

2 結果與分析

2. 1 平皿試驗結果

顯微觀察結果顯示，接種供試菌株的鐵皮石斛苗根部均可發現深色有隔內生真菌（Dark septate endophyte，DSE）的典型結構——微菌核和菌絲（圖1），通過形態學觀察后確定為原接種菌株，即相關菌株已與鐵皮石斛苗建立了共生體。6批次的平皿培養結果顯示，有30株菌株可促進鐵皮石斛苗生長，鐵皮石斛植株總干重均高于同一批次的對照，其中，包含菌株HS40在內的第一批次試驗結果詳見表1。分別接種HS40等菌株后，鐵皮石斛苗總干重較同一批次對照總干重極顯著提高（P<0.01，下同）。

2. 2 盆栽試驗結果

選取平皿培養效果較好的菌株進行盆栽試驗，結果顯示，相關菌株均能與鐵皮石斛建立共生體系，其中，接種菌株HS40的鐵皮石斛苗整體長勢較佳，且株高較一致（圖2）。由表2可看出，接種菌株HS40的鐵皮石斛株高、分蘗數、總鮮重、總干重分別較對照增加21.7%、375.0%、94.7%和57.6%，其中，株高、總鮮重和總干重與對照相比差異極顯著，分蘗數與對照相比差異顯著（P<0.05）。綜合平皿培養和盆栽試驗結果判斷，菌株HS40的促生功能最穩定，效果也最佳。

2. 3 優良促生菌株HS40對鐵皮石斛多糖積累的影響

多糖含量測定結果（圖3）顯示，接種優良促生菌株HS40的鐵皮石斛苗莖干多糖含量比對照增加15.8%，與對照的差異極顯著。可見，菌株HS40可顯著促進鐵皮石斛次生代謝產物多糖的積累。

2. 4 菌株HS40的形態學鑒定結果

菌株HS40的菌落形態及產孢結構見圖4。鐵皮石斛優良促生菌株HS40在CMMY培養基上長速一般，28 ℃下培養2周后菌落直徑在25 mm左右，菌落圓形，呈輻射狀凹陷，絨氈狀，顏色呈灰棕色、黃褐色至褐色;菌絲淺黃褐色，有隔，直徑1.4～4.0 μm。分生孢子梗為黃褐色，2～6個分隔，直立，無分枝，頂端常具1～3個突臍，近圓柱形，直立或稍彎曲，大小為23.2～154.2 μm×2.2～5.5 μm（平均69.1 μm×3.5 μm，n=54）;分生孢子淺黃褐色至黃褐色，近圓柱形或棍棒狀，表面具疣，0～多隔膜，常以未分支的鏈狀出現，大小為8.3～60.2 μm×1.8～3.6 μm（平均31.7 μm×2.8 μm，n=57）。上述特征與Zasmidium citri-griseum的形態特征基本相符（Braun et al.，2014;黃峰，2015）。

2. 5 菌株HS40的分子鑒定結果

通過菌株HS40的ITS片段擴增獲得一條531 bp的基因序列，其GenBank登錄號為KY496825。在GenBank中進行序列比對分析，結果顯示菌株HS40的ITS序列與Zasmidium citri和Z. citri-griseum的ITS序列同源性分別為98.49%和98.29%。基于ITS序列同源性構建的系統發育進化樹（圖5）顯示，菌株HS40以90%的支持率與Z. citri-griseum和Z. citri聚在一大支上。此外，采用NS1和NS4為引物進行18S rDNA序列擴增，獲得一條1015 bp基因序列，GenBank登錄號為KY576814，在GenBank進行序列比對分析，結果表明，菌株HS40的18S rDNA序列與登錄號分別為KY873383、GU214597的Z. citri-griseum 18S rDNA序列同源性分別為100.00%和99.90%，基于18S rDNA同源性構建的系統發育進化樹如圖6所示，菌株HS40與Z. citri-griseum聚在一個分支上。結合形態學鑒定結果，將菌株HS40鑒定為Z. citri-griseum。

3 討論

本研究首次嘗試從北部灣紅樹植物內生真菌中篩選出能顯著促進鐵皮石斛生長的內生真菌，最終成功獲得3株目標菌株，其中，菌株HS40的綜合表現最佳。該菌株分離自廣西北海市山口國家紅樹林生態自然保護區的木欖莖部，能成功定殖于鐵皮石斛苗根部的皮層和外皮層，不僅未對鐵皮石斛造成為害，還能促進鐵皮石斛生長，說明該菌株與鐵皮石斛間建立了共生關系，但具體的共生機制仍需深入探討。此外，無論在OMA培養基上還是水草栽培基質中，菌株HS40對鐵皮石斛苗均表現出良好的促生效果，且在盆栽條件下表現更明顯。該菌株可顯著促進鐵皮石斛生長和多糖積累的表現與從蘭科植物中分離獲得的內生真菌表現（陳曉梅和郭順星，2005;帥紅艷，2008）基本一致。后續小規模應用示范結果也證明，菌株HS40可促進另一鐵皮石斛品種的生長和多糖積累，進一步驗證在挖掘鐵皮石斛內生真菌資源時，可拓寬宿主植物的范圍，也再次證明DSE宿主范圍的廣泛性（Wu and Guo，2008;Diene et al.，2010;Andrade-Linares et al.，2011）。

在本研究獲得的3株鐵皮石斛優良促生菌株中，僅有菌株HS40可產生孢子，可對其進行分類鑒定;而另外2株菌株一直以無性態存在，至今未能成功誘導其產生孢子，難以結合形態特征與分子鑒定結果對其進行精準鑒定。本研究通過形態特征分析，結合ITS序列、18S rDNA序列比對及系統發育進化樹構建，并反復與Fisher（1961）、Whiteside（1972）、Crous等（2009）、Braun等（2014）、黃峰（2015）等的研究結果進行比較，最終將鐵皮石斛優良促生菌株HS40鑒定為球腔菌科（Mycosphaerellaceae）平臍疣孢屬（Zasmidium）的Z. citri-griseum。Z. citri-griseum與Cercospora citri-grisea屬于基原異名，與Stenella citri-grisea、Z. citri屬于同物異名（Braun et al.，2014;黃峰，2015）。本課題組前期研究紅樹植物內生真菌多樣性時發現，菌株HS40與Z. citri（KF240807.1）的ITS序列同源性達98%，而與Z. anthuriicola（GU214595.1）的18S rDNA序列同源性高達99%（張艷等，2017）。進一步深入研究發現，菌株HS40的菌落形態特征、孢子梗、孢子形態特征均與Z. citri griseum更相符，且隨著GenBank供參考信息的不斷豐富，相關序列對比結果也支持菌株HS40與Z. citri-griseum屬于同一個種的判斷。

鑒于前人研究發現Z. citri-griseum分別屬于柑橘屬果樹（Fisher，1961;Whiteside，1972;Braun et al.，2014;黃峰，2015）、桐花樹（孫興濤，2017）等植物的病原菌，因此在生產上對菌株HS40進行開發和應用前，要做好安全評估，以明確其適用范圍。

4 結論

菌株HS40在平皿培養和盆栽試驗中，對鐵皮石斛的生長均表現出顯著促進作用，且接種菌株HS40可顯著提高盆栽鐵皮石斛莖干多糖含量。該研究結論為菌株HS40在生產上的推廣應用提供了數據支撐，為下一步開發鐵皮石斛專用菌劑（肥）提供了理論依據，也可為內生真菌在廣西其他特色作物上的開發應用提供參考。

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