紫苑環肽對氧化脅迫下釀酒酵母細胞的保護作用

朱作藝，張玉，王君虹，李雪，王偉,2*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江省植物有害生物防控重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

紫苑(AstertataricusL.F.)為菊科植物的干燥根及根莖，作為傳統中藥已經具有2 000多年的歷史，具有潤肺下氣、化痰止咳的功能[1]，主要分布于東北、華北地區，以及甘肅、安徽等省，現已在國內大面積種植。紫苑環肽(astins)是從紫苑根莖中分離出來的一類鹵代的環五肽類，目前已鑒定的紫苑環肽結構有3種，分別為astin A、astin B和astin C。有文獻報道，astin A、astin B和astin C具有抗腫瘤活性[2]、誘導細胞凋亡和自噬的作用[3]。

酵母細胞同其他真核生物一樣，在生長過程中要不斷承受來自內外環境的壓力。正常需氧條件下，酵母細胞中的代謝副產物會產生超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等內源性活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)。外界環境中的電離輻射、氧化還原劑或重金屬等也能刺激細胞產生這些活性氧形態。在氧化脅迫條件下，酵母會產生過多的活性氧自由基。當細胞中累積的這些活性氧物質超過了細胞抗氧化防御緩沖能力時，會對酵母細胞的許多重要生物大分子發生不可逆轉的氧化損傷，使核酸、蛋白質、膜多不飽和脂肪酸等出現交聯或斷裂，導致細胞結構和功能的破壞，甚至造成細胞死亡[4-8]。

本文建立以H2O2為氧化誘導劑的釀酒酵母細胞模型，從細胞存活率、細胞生長表型分析和ROS含量等不同方面來研究紫苑環肽(astin A和astin B)對氧化受損的酵母細胞的保護作用，為進一步研究紫苑環肽活性物質和后續的功能食品、保健品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫苑環肽(astin A，純度95%；astin B，純度95%，吉爾生化(上海)有限公司合成)；野生型釀酒酵母細胞BY4742(武漢淼靈生物科技有限公司)；瓊脂粉(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)；酵母提取物(杭州微生物試劑有限公司)；胰蛋白胨(國藥集團試劑有限公司)；葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)；30%過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；酵母破壁酶溶液(上海索萊寶生物技術有限公司)；真菌/酵母氧化應激活性氧(ROS)比色法定量試劑盒(上海杰美基因醫藥科技有限公司)；細胞凋亡試劑盒(杭州聯科生物公司)。

pH計(FE28，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHP-9602恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州蘇凈有限公司)；MX-S混勻儀(大龍興創試驗儀器(北京)有限公司)；紫外-可見光分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；TDL-60B低速臺式離心機(上海安亭設備有限公司)；MicroPure UV/UF純水儀(美國Thermo公司)；ACCURI C6流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 紫苑環肽溶液的配制

將5 mg合成的高純環肽(astin A和astin B)溶于含1%二甲基亞砜(DMSO)的5 mL無菌蒸餾水中，配制成環肽母液，使用時以1∶100比例加入培養基中。

1.2.2 YPD培養基配制

稱取20.0 g胰蛋白胨，10.0 g酵母提取物，20.0 g葡萄糖，若配制固體培養基，則再加20.0 g瓊脂粉。將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調節pH至7.2±0.2，分裝后于121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.3 生理鹽水配制

稱取氯化鈉8.5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱溶解，分裝后121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.4 試驗細胞分組

從平板上挑取酵母菌于YPD培養基中30 ℃預培養，以終濃度D600=0.05轉移至新鮮YPD中培養至對數期，收集細胞調節濃度至D600=2.0(為酵母細胞生長對數期，使細胞濃度大約為5×107CFU·mL-1)。按照以下分組，加入2種環肽和2 mmol·L-1H2O2處理酵母細胞，每組設置3個平行試驗。

NC：YPD+2 mmol·L-1H2O2；astin A：YPD+10 mg·L-1astin A；astin B：YPD+10 mg·L-1astin B；H2O2+ astin A：PD+2 mmol·L-1H2O2+10 mg·L-1astin A；H2O2+ astin B：YPD+2 mmol·L-1H2O2+10 mg·L-1astin B。

1.2.5 酵母細胞表型生長觀察

按照上述分組處理酵母細胞，37 ℃作用90 min后離心收集菌體，用無菌生理鹽水清洗藥物，并重懸于1 mL生理鹽水中，然后進行梯度稀釋，每個梯度按1∶10進行稀釋，直至稀釋到1∶1 000，然后將每個稀釋濃度從高濃度到低濃度各取5 μL，按照從左到右順序依次滴加于YPD固體平板上。待菌液完全滲透到培養基后，將平板倒置30 ℃培養2 d。將培養完成后的YPD平板進行拍照記錄。

1.2.6 酵母活性氧(ROS)測定

按照上述分組處理酵母細胞，37 ℃作用2 h后離心收集菌體，用無菌生理鹽水清洗藥物，棄上清液。按照真菌/酵母氧化應激活性氧(ROS)比色法定量試劑盒說明書測定各組酵母菌活性氧含量。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞壞死凋亡

按照上述分組處理酵母細胞，37 ℃作用2 h后離心收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，加入500 μL 15U·mL-1酵母破壁酶溶液，28 ℃培養1 h進行去壁。離心收集細胞，用生理鹽水去除酶液，將細胞重懸在100 μL Binding Buffer上樣緩沖液中。先在每個樣品加入5 μL Annexin V，混勻且室溫下避光10 min，之后在每個樣品中加入5 μL PI。室溫下避光反應5 min。之后再加入400 μL Binding Buffer上樣緩沖液，進行流式細胞儀分析。

2 結果與討論

2.1 紫苑環肽對釀酒酵母細胞表型生長情況的影響

從不同組別菌液在YPD平板上生長狀態(圖1)可知，在培養菌液中加入2 mmol·L-1H2O2(YPD+H2O2組)，相較于YPD+10 mg·L-1astins環肽組，其菌落成活率在稀釋1 000倍時有明顯下降，然而向氧化脅迫的酵母細胞體系中加入環肽干預(YPD+H2O2+10 mg·L-1astins環肽組)，可明顯提高酵母細胞的成活率。從1∶1 000倍稀釋的菌液在YPD平板上生長狀態可知，YPD+H2O2+10 mg·L-1astin A組別的酵母細胞成活率高于YPD+H2O2+10 mg·L-1astin B組。表明在氧化脅迫體系中，紫苑環肽astin A對酵母細胞的保護效果優于紫苑環肽astin B。

2.2 紫苑環肽對釀酒酵母細胞活性氧含量的影響

通過檢測不同組別真核細胞(酵母)的活性氧ROS含量的變化情況，研究紫苑環肽對氧化脅迫條件下酵母細胞的保護作用。由圖2可知，對照組ROS含量顯著高于astin A和astin B，說明在H2O2的氧化脅迫下，酵母細胞內ROS含量明顯上升，astin A和astin B的ROS含量顯著下降，其他各組活性氧ROS含量相較于對照組均有顯著降低(P<0.05)。

2.3 紫苑環肽對酵母細胞壞死凋亡情況的影響

由圖3可知，加入H2O2后的酵母菌出現大量壞死，細胞壞死率為96.5%，極顯著高于其他處理。astin A處理的細胞壞死率和凋亡率均為0.8%，而H2O2+astinA處理組細胞壞死率和凋亡率分別為30.7%和0.7%；astin B處理的細胞壞死率和凋亡率分別為0.8%和0.6%，而H2O2+astin B處理的細胞壞死率和凋亡率分別為35.9%和1.5%。由此可知，紫苑環肽對正常酵母細胞無損傷作用，但可顯著降低酵母細胞的壞死率(P<0.001)，通過分別加入10 mg·L-1的astin A和astin B至H2O2處理的酵母細胞，其壞死率從96.5%分別降至30.7%和35.9%，表明紫苑環肽對氧化脅迫的酵母細胞具有明顯的保護作用。

**表示與對照比差異極顯著(P<0.01)。

3 小結

通過研究氧化脅迫的野生型釀酒酵母細胞在紫苑環肽作用下的生長表型情況、活性氧含量及細胞壞死凋亡情況，證實紫苑環肽對由H2O2引起的氧化損傷釀酒酵母細胞具有保護作用。試驗結果表明，紫苑環肽能顯著提高氧化脅迫下釀酒酵母細胞的存活率，降低細胞內ROS含量，這為進一步研究開發紫苑在食品、藥品及人類健康方面的應用提供了重要依據。