胡蘿卜濃縮汁中耐熱菌的分離及特性研究

劉彩琴 魏興虎 王 楠 陳蔚青 陳 虹 呂 韻 鄭 剛

(1. 浙江樹人大學生物與環境工程學院,浙江 杭州 310015;2. 山東金得利食品有限公司,山東 濟寧 272200)

果汁營養豐富，但pH多為2.4～4.2[1]，其常見污染菌為耐熱、耐酸的霉菌、酵母菌和細菌[2-6]。耐熱細菌如酸土環脂芽孢桿菌(Aliyclobacillusacidoterrestris)常引起巴氏滅菌果汁在常溫條件下濁度升高，是濃縮果汁生產中最重要的目標控制微生物[7-8]；耐熱霉菌如多變擬青霉、尖孢鐮刀菌、絲衣霉、籃狀菌、新薩托菌和布氏正青霉、正青霉等常引起巴氏殺菌果汁的腐敗[1]；魯氏接合酵母、釀酒酵母、出芽短梗霉等是導致果汁腐敗變質的酵母菌[9-10]。控制微生物污染一直是果汁工業努力解決的難題，不同的原料使加工工藝、果汁的糖度和酸度等不相同，耐熱微生物種類也不盡相同。

濃縮胡蘿卜汁是中國復合果汁飲料和酸奶加工中常用的原料，經115～120 ℃殺菌處理30 s，其pH為6.0左右;為低酸性食品[11]，冷藏條件下極少出現腐敗變質現象。試驗擬對某企業脹袋胡蘿卜濃縮汁中耐熱微生物進行分離及特性研究，以期為胡蘿卜濃縮汁加工、保藏和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

胡蘿卜濃縮汁：-18 ℃保存，山東某果汁生產企業。

1.1.2 試劑

PDA培養基、各種生化管：杭州微生物試劑有限公司；

麥芽汁瓊脂(MEA)培養基：北京陸橋技術股份有限公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

電子分析天平：PL303型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，金壇市江南儀器廠；

酸度計：FE20型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：GR60DA型，致微儀器有限公司；

超凈工作臺： HJ-VD-650型，上海蘇凈實業有限公司；

生化培養箱：SPX-250B-Z型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

搖床：SW-CJ-1C型，上海福瑪實驗設備有限公司；

生物顯微鏡：YS100型，尼康儀器(上海)有限公司；

超聲波細胞粉碎機：JY92-2D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計：UVmini-1240型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 耐熱菌的分離及純化

(1) 耐熱菌的富集培養：參照胡貽椿等[12]的方法并進行修改。吸取50 mL無菌樣品，加入250 mL無菌三角燒瓶中，80 ℃水浴13 min，然后迅速冷卻至45 ℃，以150 r/min搖床培養2 d。

(2) 分離及純化：將培養后的樣品用無菌生理鹽水分別稀釋至10-1，10-2，…，10-8。吸取濃度為10-7，10-8梯度的樣液200 μL，涂布于PDA培養基平板上，28 ℃培養2～5 d，挑取典型單菌落，保藏并備用。

1.2.2 耐熱菌的形態及理化特性

(1) 菌株形態：純化后的菌株接種于MEA平板上，28 ℃培養3 d，觀察菌落形態。

(2) 碳源利用情況：按D-葡萄糖、甘油、D-木糖、側金盞花醇、肌醇、山梨醇、纖維二糖、D-乳糖(牛源)、海藻糖、D-松三糖、木糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、D-麥芽糖、α-甲基-D-葡萄糖、D-棉籽糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺、D-蔗糖生化鑒定管的要求接種耐熱菌，考察菌株對碳源的利用情況。

(3) 菌株的耐熱性：菌株經液體培養72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，取適量稀釋液于80，90 ℃水浴鍋中分別水浴5，10，15，20，25，30 min。分別涂布于PDA培養基上，于28 ℃恒溫培養箱中培養2～5 d，觀察生長情況。

(4) 菌株的耐酸特性：將液體培養72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，分別接種于pH為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的PDA培養基上(1 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調節)，于28 ℃恒溫培養2～5 d，觀察生長情況。

1.2.3 耐熱菌的鑒定 由中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心進行分子鑒定。

1.2.4 超聲波功率對耐熱菌色素提取效果的影響 參照葉偉慶等[13]的方法并進行修改。取適量培養48 h的發酵液，5 000 r/min離心15 min，沉淀經蒸餾水清洗3次，得濕菌泥1 g，加入 3 mol/L HCl 溶液10 mL，于200，400，600，800 W下超聲1 h(每超聲5 s間隔10 s)，沸水浴10 min，再用冰水浴速冷，5 000 r/min離心15 min，得到上清液和紅色沉淀。

(1) 還原糖和多糖含量的測定：分別采用DNS法[14]和苯酚硫酸法[14]測定上清液中還原糖和多糖含量。

(2) 吸光度值的測定：紅色沉淀經蒸餾水清洗3次后，加入10 mL丙酮溶液浸提12 h，離心取紅色上清液，于400～800 nm下測定吸光值。

1.3 數據處理

所有試驗均為3次平行，數據經Excel軟件分析；采用MEGA 5.0軟件，鄰近連接法分析“SR-1”與相關種的ITS rDNA序列系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 耐熱菌的形態及理化特性

2.1.1 菌株形態 通過分離、篩選及純化，得到1株經85 ℃水浴30 min后長勢良好的粉紅色菌株SR-1。由圖1可知，SR-1在MEA培養基上呈奶油狀，粉紅色，表面反光，邊緣整齊，菌落平伏，不透明。由圖2可知，SR-1菌株在顯微鏡下細胞呈腎形，芽殖，大小為3.0～13.0 μm×3.0～5.0 μm。綜上，菌株SR-1為酵母菌，與文獻[15-16]中擲孢酵母屬特征相近，孢子形狀與王啟明等[17]報道的腎形相似，初步判定為擲孢酵母。

圖1 SR-1的菌落形態

圖2 SR-1的細胞形態

2.1.2 碳源利用情況 由表1可知，菌株SR-1可利用單糖如D-葡萄糖，能利用二糖如海藻糖、D-麥芽糖、D-蔗糖，能利用三糖如D-松三糖、D-棉籽糖，也能利用山梨醇，但不能利用甘油、D-木糖、側金盞花醇、肌醇、纖維二糖、D-乳糖(牛源)、木糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、α-甲基-D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、N-乙酰葡糖胺，與已報道[16]的擲孢酵母對碳源的利用情況不一致，與Yang等[18]的肉色擲孢酵母對D-木糖、纖維二糖和側金盞花醇利用情況不同。

表1 菌株SR-1對部分碳源的利用情況?

? “+”代表反應陽性；“-”代表反應陰性。

2.1.3 耐熱耐酸特性 由表2可知，菌株SR-1經80 ℃水浴5，10，15，20，25，30 min后均在PDA培養基上生長良好；經90 ℃水浴5 min后能較好生長，水浴10，15 min后有生長，但長勢不良，水浴20，25，30 min后不再生長，說明SR-1較耐熱。由表3可知，菌株SR-1在pH 6.0～8.0下生長良好，在pH 4.0，5.0下能生長，但長勢不好，在pH<3.0時不能生長，表明菌株SR-1在pH 3.0以下的強酸性環境中不能生長，但在pH 4.0以上均能生長，且在中性及偏堿性環境中生長良好，與溫洪宇等[19]的結論相似。

2.2 菌株SR-1的ITS rDNA序列及分析

提取菌株SR-1的DNA，設計引物并PCR擴增，得到最終的ITS rDNA序列，序列長度為550 bp。由圖3可知，SR-1與擲孢酵母屬(Sporobolomyces)中的模式菌株SporobolomycescarnicolorJCM 3766T(登錄號為AY069991)聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，表明其親緣關系最近。故將菌株SR-1命名為肉色擲孢酵母(Sporobolomycescarnicolor)SR-1。

表2 菌株SR-1的耐熱特性?

? “+++”代表生長良好；“++”代表生長較好；

“+”代表生長；“-”代表不生長。

表3 菌株SR-1的耐酸特性?

? “+++”代表生長良好；“++”代表生長較好；“+”代表生長；“-”代表不生長。

2.3 超聲波功率對菌株SR-1色素提取效果的影響

由圖4可知，菌株SR-1上清液還原糖含量為6.02～7.86 mg/mL，多糖含量為32.93～41.78 mg/mL。當超聲功率為600 W時，還原糖含量最高；當超聲功率為400 W時，多糖含量最高。酵母胞內還原糖主要來源于細胞質中還原性糖類，如葡萄糖、果糖等，適度的超聲處理有利于其釋放；酵母胞內多糖主要來源于細胞壁中的葡聚糖和甘露聚糖等多糖[20]，適度的破壁處理可使多糖充分釋放；與王慧等[21]研究結果類似。

由圖5可知，當超聲功率為200，400，600 W時，菌體的丙酮提取液在414.0，539.0，634.0 nm處各有3個吸收峰，以539 nm處吸收峰值最大；當超聲功率為800 W時，丙酮提取液在414 nm處無吸收峰，在539，634 nm處各有一吸收峰，仍以539 nm處吸收峰值最大。現有資料[22]顯示，β-胡蘿卜素的吸收峰為430，450，475 nm，圓酵母素的吸收峰為459，482，515 nm，紅酵母紅素的吸收峰為470，492，521 nm，與試驗結果不同。

3 結論

試驗從產氣、脹袋的胡蘿卜濃縮汁中分離出一株耐熱菌SR-1，經形態學和ITS rDNA 基因序列分析為酵母菌屬的肉色擲孢酵母，該菌經80 ℃熱處理5～30 min和90 ℃熱處理15 min以下均可生長，經90 ℃熱處理20 min后不能生長；在pH 6.0～8.0環境中生長良好，在pH 3.0以下不生長。以鹽酸為溶劑輔以超聲波破壁技術，有利于菌株還原糖、多糖和色素的溶出，肉色擲孢酵母SR-1丙酮提取液吸收峰為414，539，634 nm。擲孢酵母SR-1對碳源的利用情況和色素吸收峰仍需進一步研究。

圖3 菌株SR-1的ITS rDNA基因序列分析聚類結果

圖4 超聲功率對菌株SR-1多糖和還原糖含量的影響

圖5 超聲功率對菌株SR-1色素提取效果的影響