褐藻糖膠對小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊作用及機制

[摘要] 目的 探討褐藻糖膠對高脂喂養的ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊模型的作用及Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥通路蛋白表達的影響。方法 雄性ApoE-/-小鼠36只，隨機分為對照組（普通飲食）、模型組（頸動脈套管+高脂飲食+生理鹽水）和褐藻糖膠組（頸動脈套管+高脂飲食+褐藻糖膠），每組12只。8周后檢測各組小鼠血脂水平，采用蘇木精-伊紅（HE）染色方法觀察小鼠右側頸總動脈病理改變，ELISA法測定炎性因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達水平，Western Blot方法檢測頸動脈粥樣硬化斑塊中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β蛋白表達水平。結果 與模型組比較，褐藻糖膠組小鼠血脂水平明顯降低，頸動脈粥樣硬化易損斑塊明顯減少，IL-1β、IL-6、TNF-α表達降低，差異均有顯著性（F=8.31～190.73，Plt;0.05）。模型組頸動脈粥樣硬化斑塊中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達較對照組顯著升高，而褐藻糖膠組各蛋白表達較模型組下降（F=50.22～120.59，Plt;0.05）。結論 褐藻糖膠能夠通過下調NLRP3炎性小體通路抑制炎癥而發揮抗頸動脈粥樣硬化作用。

[關鍵詞] 褐藻糖膠;斑塊，動脈粥樣硬化;NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3

[中圖分類號] R543.5 "[文獻標志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）05-0536-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.131 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of fucoidan on carotid atherosclerotic vulnerable plaques and expression of Nod-like receptor family， pyrin domain-containing protein 3 （NLRP3）-related inflammatory pathway proteins in ApoE-/- mice fed with high-fat diet. "Methods A total of 36 male ApoE-/- mice were randomly divided into control group （normal diet）， model group （carotid collar+high-fat diet+normal saline）， and fucoidan group （carotid collar+high-fat diet+fucoidan）， with 12 mice in each group. After 8 weeks， blood lipid levels were measured; hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of the right common carotid artery; ELISA was used to measure the levels of the inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）; Western Blot was used to measure the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in atherosclerotic plaques. Results Compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in blood lipid levels， carotid atherosclerotic vulnerable plaques， and expression of IL-1β， IL-6， and TNF-α （F=8.31-190.73，Plt;0.05）. Compared with the control group， the model group had significant increases in the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in carotid atherosclerotic plaques， and compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in the expression of these proteins （F=50.22-120.59，Plt;0.05）. "Conclusion Fucoidan can effectively atte-nuate carotid atherosclerosis by downregulating the NLRP3 inflammasome pathway.

[KEY WORDS] fucoidan; plaque， atherosclerotic; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein

缺血性腦卒中是威脅人類生命的主要疾病之一[1]，其主要危險因素是頸動脈粥樣硬化[2]。有研究表明，頸動脈粥樣硬化是一種緩慢發展的免疫炎癥反應過程[3]，從粥樣硬化斑塊形成、發展至斑塊破裂，多種炎癥細胞和炎癥因子參與其中[4]。因此，探討抑制炎癥反應的干預措施以控制動脈粥樣硬化發生發展，對治療缺血性腦卒中具有重要意義。褐藻糖膠是海洋類褐藻植物中一種特有的多糖，有研究表明褐藻糖膠能夠調節脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥因子釋放，抑制核轉錄因子κB（NF-κB）活化而反應性抑制促炎基因表達[5]，但其對頸動脈易損斑塊的作用及具體機制尚未有研究。Nod樣受體蛋白3（NLRP3）在動脈粥樣硬化發生發展過程中具有重要作用[6-8]，NLRP3基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊及炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）分泌明顯降低[9]。本實驗通過構建高脂喂養的ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊模型，觀察褐藻糖膠對頸動脈斑塊NLRP3炎性小體相關蛋白表達影響，探討褐藻糖膠對頸動脈粥樣硬化的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

褐藻糖膠（Sigma-Aldrich公司），用0.22 mm孔徑過濾器進行過濾，并在-20 ℃條件下保存為褐藻糖膠提取物（10 g/L），直至使用。6周齡大小C57BL/6背景ApoE-/-基因敲除雄性小鼠（北京Vital River公司）36只，體質量為18～22 g，標準條件下飼養于青島大學醫學部實驗動物中心，自由進食、飲水，每籠3只，適應性喂養2周后用于實驗。NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β（CST公司），ELISA檢測試劑盒（eBioscience公司），ECL顯影液（Millipore公司）。

1.2 動物分組及處理

將36只小鼠隨機分成對照組、模型組、褐藻糖膠組（實驗組），每組12只。模型組、褐藻糖膠組小鼠于右側頸總動脈插入頸動脈套管，并給予高脂飼料（每100.00 g飼料含膽固醇0.25 g、脂肪15.00 g）喂養制備小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊模型[10]。對照組不手術，給予普通飼料喂養。模型制備后第4周褐藻糖膠組小鼠給予褐藻糖膠30 mg/（kg·d）腹腔注射，對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，共注射4周。所有動物研究經青島大學附屬醫院實驗動物管理委員會批準，并遵循美國國立衛生研究院修訂的《實驗動物管理和使用指南》[11]。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 標本采集 小鼠禁食12 h（正常飲水），腹腔注射100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，內眥動脈取血;處死小鼠后固定于鼠板，沿頸部正中線剪開皮膚，暴露右側頸總動脈，然后剪下套管兩端長度約0.5 cm血管。

1.3.2 血脂測定 取小鼠內眥動脈血約3 mL，3 000 r/min離心取上清，測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）水平。

1.3.3 病理觀察 將離體的右側頸總動脈用40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脫水、浸蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察血管動脈粥樣硬化形成情況。1.3.4 血清IL-1β、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平檢測 采用ELISA方法分別檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按試劑盒說明書操作。

1.3.5 頸動脈粥樣硬化斑塊組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平測定 應用Western Blot方法。用RIPA裂解液裂解頸動脈組織，BCA法測定蛋白質含量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后轉到PVDF膜上。室溫封閉后2 h后與一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌后，加二抗在室溫下孵育1 h，ECL顯影。應用圖像分析軟件對圖像進行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內兩兩比較采用LSD法。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 各組小鼠血清脂質水平比較

模型組血清TC、TG、LDL水平與對照組比較明顯升高，而褐藻糖膠組血清TC、TG、LDL水平較模型組明顯降低，差異有統計學意義（F=8.31～126.25，Plt;0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊形成比較

光鏡下可見，對照組小鼠血管未見明顯粥樣斑塊，管壁3層結構明顯，內膜完整;模型組小鼠頸動脈內見明顯粥樣硬化斑塊形成，斑塊內見泡沫細胞浸潤，部分破裂，血栓形成;而褐藻糖膠組小鼠頸動脈內粥樣斑塊明顯減輕，泡沫細胞減少。見圖1。

2.3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

模型組小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達較對照組升高，褐藻糖膠組各血清炎癥因子水平較模型組下降，差異有統計學意義（F=60.21～190.73，Plt;0.05）。見表2。

2.4 各組NLRP3炎性小體通路相關蛋白表達比較

與對照組比較，模型組小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表達明顯增高;與模型組比較，褐藻糖膠組NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達降低，差異有顯著性（F=50.22～120.59，Plt;0.05）。見圖2、表3。

3 討 "論

炎癥在動脈粥樣硬化發生和發展以及血栓形成中起著重要的作用[3]。褐藻糖膠是以L-褐藻糖為基礎的多糖，具有多種生物學功能，包括抗炎、抗血管生成、抗凝血、抗腫瘤等，是天然海洋藥物研究的熱點[12-14]。然而，褐藻糖膠在動脈粥樣硬化中的作用及其機制尚不清楚。本文利用頸動脈套管合并高脂飼料飼養構建ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊模型，探討褐藻糖膠對ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化的作用及其機制。

有研究結果顯示，褐藻糖膠可以調節高脂喂養ApoEshl小鼠血脂水平及動脈粥樣硬化進展[15]。本文結果與其一致。本文結果顯示，褐藻糖膠干預后小鼠血清TC、TG和LDL水平較模型組明顯降低;病理觀察顯示，與對照組相比，模型組頸動脈血管內壁有大量脂質及泡沫細胞堆積，血管腔嚴重堵塞，而褐藻糖膠組頸動脈血管內壁斑塊面積及脂滴明顯減少，提示褐藻糖膠能夠緩解小鼠頸動脈粥樣硬化易損斑塊的發生和進展。TNF-α介導全身炎癥和免疫反應，在慢性炎癥性疾病的發生發展過程中均發揮作用[16-17]。IL-6及IL-1β都是促炎性細胞因子，可刺激炎癥的產生，促進免疫性疾病的發生，在動脈粥樣硬化過程中起到重要作用[18-20]。有研究顯示，褐藻糖膠能夠調節LPS誘導的巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子[21]。本文ELISA檢測顯示，褐藻糖膠能夠明顯降低ApoE-/-小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌。表明褐藻糖膠能夠通過抑制炎癥反應而發揮抗動脈粥樣硬化作用。

研究表明，褐藻糖膠能夠影響炎癥因子IL-1β表達，而在眾多調節炎性因子IL-1β成熟和分泌的通路中，NLRP3炎性小體依賴性的經典通路尤為重要[7，20]。NLRP3炎癥小體是NLRs家族中的一員，是由感受蛋白NLRP3、銜接蛋白凋亡相關斑點樣蛋白ASC和效應蛋白激酶Caspase-1等組成的復合物[22-23]。已有研究顯示，膽固醇結晶、氧化低密度脂蛋白、血流動力異常都會激活單核巨噬細胞NLRP3炎癥小體，進而誘導Caspase-1介導的炎性細胞因子IL-1β的成熟分泌，導致心腦血管疾病和事件的發生[24]。因此，抑制NLRP3炎性小體能夠控制動脈粥樣硬化的發展，穩定動脈粥樣硬化斑塊，降低因不穩定斑塊造成的缺血性腦卒中的風險。本文采用Western Blot方法檢測小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊組織NLRP3炎性小體及IL-1β水平，結果顯示，與模型組相比較，褐藻糖膠組NLRP3蛋白的表達降低，Caspase-1蛋白及下游炎性細胞因子IL-1β表達減少，一定程度上表明褐藻糖膠能夠通過下調NLRP3炎性小體相關蛋白表達而發揮抗炎作用。

綜上所述，褐藻糖膠能夠通過下調NLRP3炎性小體通路抑制炎癥而發揮抗頸動脈粥樣硬化作用。本文結果可為抗動脈粥樣硬化輔助治療提供候選藥物。

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（本文編輯 黃建鄉）