載脂蛋白D對多巴胺能神經元的保護作用

[摘要] 目的 探討載脂蛋白D （Apo D）對多巴胺能神經元保護作用。方法 首先觀察25～500 μmol/L的1-甲基-4-苯基吡啶陽離子（MPP+）對MES23.5細胞存活率的影響，確定最佳造模濃度;在此基礎上觀察2～32 nmol/L Apo D預處理對200 μmol/L的MPP+誘導的MES23.5細胞存活率的影響。結果 與MPP+處理組相比，8 nmol/L Apo D預處理可明顯拮抗MPP+誘導的MES23.5細胞存活率的降低，差異有顯著性（F=85.06，Plt;0.01）。結論 外源性Apo D可拮抗多巴胺能神經元損傷并發揮其保護作用，這為PD的防治提供新的思路。

[關鍵詞] 帕金森病;載脂蛋白D類;多巴胺能神經元

[中圖分類號] R742.5 "[文獻標志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）02-0140-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.093 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1433.005.html;2020-05-20 08：59

[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of apolipoprotein D （Apo D） on dopaminergic neurons. Methods First， the effect of 25-500 μmol/L 1-methyl-4-phenylpyridiniumion （MPP+） on the survival rate of MES23.5 cells was observed to find the optimal modeling concentration. Then on this basis， the effect of 2-32 nmol/L Apo D pre-treatment on the survival rate of MES23.5 cells induced by 200 μmol/L MPP+ was observed. "Results Compared with the MPP+ treatment group， 8 nmol/L Apo D pre-treatment could significantly antagonize MPP+-induced decrease in the survival rate of MES23.5 cells （F=85.06，Plt;0.01）. "Conclusion Exogenous Apo D can antagonize dopaminergic neuronal injury and exert a protective effect， which provides new ideas for the prevention and treatment of Parkinson’s disease.

[KEY WORDS] Parkinson disease; apolipoproteins D; dopaminergic neurons

帕金森病（PD）是一種多發于中老年人中樞神經系統的退行性疾病，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢反射性障礙等[1-2]。PD的主要病理特征是中腦黑質（SN）多巴胺能神經元選擇性缺失，殘存的神經元內出現以α-突觸核蛋白（α-Syn）異常聚集為主形成的路易小體（LBs）[3-4]。PD的病因尚未明確，與氧化應激、自由基形成、金屬動態平衡和線粒體功能障礙相關的機制都有涉及[5]。最近的研究表明，PD轉基因小鼠大腦膽固醇水平升高，而載脂蛋白參與膽固醇穩態的維持，載脂蛋白與PD之間可能存在聯系[6-8]。載脂蛋白D（Apo D）是載脂蛋白家族的成員之一[9]，在中樞神經系統中，Apo D主要由星形膠質細胞和少突膠質細胞產生和分泌，為在衰老的大腦、神經退行性疾病和精神疾病中始終過量表達的少數基因之一[10-11]。研究表明，轉基因小鼠Apo D過表達導致其對氧化應激的抗性增強[12-15]。相反，小鼠、植物和果蠅中的Apo D失活導致氧化抗性降低，從而降低其存活率[13，16-19]。那么，Apo D對PD病理細胞模型是否具有保護作用呢？本研究探討Apo D對多巴胺能神經元的作用，以期為PD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

將MES23.5細胞在含有體積分數0.05的胎牛血清和100 kU/L青霉素和鏈霉素的DMEM-F12（Gibco，USA）培養液中培養。細胞以1×105/cm2的密度接種在平板中，生長到70%～80%融合度，將細胞分為4組。①對照組：與ddH2O預孵育48 h;②MPP+處理組：與ddH2O預孵育24 h，然后加入200 μmol/L MPP+孵育24 h;③Apo D處理組：與2～32 nmol/L Apo D（Biovendor，USA）共孵育48 h;④Apo D-MPP+組：與2～32 nmol/L ApoD預孵育24 h，然后與200 μmol/L MPP+孵育24 h。

1.2 細胞活力測定

應用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）測定法測定細胞活力。各組細胞經處理后，將培養基換成最終濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃條件下放置4 h。棄去培養基，向各孔加入100 μL DMSO，于搖床震蕩10 min至晶體完全溶解，使用酶標儀（Molecular Device，USA）分別檢測494 nm和630 nm波長處吸光度（A）值，計算各組細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度均值（A494-A630）/陰性對照組吸光度均值（A494-A630）×100%。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，符合正態分布的計量資料結果以±s表示。多組均數的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），繼以 Tukey方法進行兩兩均數間的比較。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 不同濃度MPP+誘導的MES23.5細胞存活率比較

MES23.5細胞經25～500 μmol/L的MPP+預處理24 h后，MTT法檢測細胞活力結果見表1。與對照組比較，25～500 μmol/L MPP+處理組細胞存活率降低（F=52.90，Plt;0.001），其中200 μmol/L處理組細胞的存活率降低了34.6%（Plt;0.001）。考慮到200 μmol/L MPP+是引起細胞損傷的最低濃度，因此選擇將其用于后續實驗。

2.2 Apo D處理對MPP+誘導的MES23.5細胞存活率降低的影響

使用2～32 nmol/L濃度范圍的Apo D預處理24 h，可以拮抗MPP+誘導的細胞毒性（F=13.20，Plt;0.001），并在8 nmol/L發揮其最大的保護作用（Plt;0.01）。見表2。不同濃度的Apo D處理沒有產生細胞毒性作用（F=4.06，Plt;0.001）。見表3。因此，Apo D預處理對MPP+處理的MES23.5細胞具有保護作用。

3 討 "論

有研究顯示，Apo D在神經退行性疾病中上調，延長了壽命并增加了果蠅的抗逆性[14]。PD病人的SN中Apo D也增加[20]，這意味著PD病人腦中Apo D與PD有關。Apo D可自由通過血-腦脊液屏障。有研究顯示，2、4、8 nmol/L Apo D可拮抗PQ處理的原代星形膠質細胞存活率的降低[12]。那么，外源給予Apo D對多巴胺能神經元是否發揮保護作用呢？本研究結果顯示，Apo D預孵育可以拮抗MPP+誘導的MES23.5細胞存活率的降低，說明Apo D對多巴胺能神經元具有保護作用;其保護作用與濃度有關，以8 nmol/L濃度保護作用最大。而單獨給予不同濃度Apo D處理MES23.5細胞的存活率沒有變化，說明外源性使用Apo D對細胞沒有毒性作用。因此，推測臨床使用Apo D應該是安全的，這為Apo D的臨床應用提供了基礎。

MPP+可以通過多巴胺再攝取系統進入細胞，并抑制線粒體呼吸鏈的復合體Ⅰ產生氧化應激，線粒體功能障礙和氧化應激引起的多巴胺能神經元變性是PD的重要特征[21]。研究表明，Apo D在轉基因小鼠中的過度表達可使其對氧化應激的抗性增強[12]。由此我們推測， Apo D對多巴胺能神經元的保護作用可能與其抗氧化應激有關。

總之，Apo D對MPP+誘導的細胞毒性具有拮抗作用，從而保護多巴胺能神經元免受氧化應激的損傷，Apo D可能對PD的治療具有臨床意義。

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（本文編輯 黃建鄉）