云南高海拔粳稻區(qū)白葉枯病菌致病力差異分析

和建平 楊雅云 張斐斐 董超 阿新祥 湯翠鳳 張恩來 申時全 戴陸園,*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學院高山經(jīng)濟植物研究所，云南 麗江674199；2 云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部云南稻種資源科學觀測實驗站，昆明650223；#共同第一作者：apingping122@163.com；*通訊作者：luyuandai@163.com）

水稻白葉枯病是世界上最嚴重的水稻細菌性病害之一，水稻受到白葉枯病菌侵染后，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重時甚至絕收[1]。1991—2014年，全國稻作區(qū)水稻白葉枯病發(fā)生面積為28.09～89.07 萬hm2，損失稻谷14 312～158 992 t[2]。水稻白葉枯病是我國南方和長江中、下游秈稻區(qū)的重要水稻病害，2010—2013年這幾個地區(qū)通過國家審定的水稻品種共103 個，其中，中感品種31 個，感、高感品種64 個，未發(fā)現(xiàn)有高抗或抗病品種[3]。水稻白葉枯病在云南冷涼粳稻區(qū)的危害也逐漸嚴重，從海拔76 m 的河口縣至2 647 m 的寧蒗縣，已有105 個縣的水稻發(fā)生此病害[4]，特別是在海拔2 200 m 的劍川縣，白葉枯病已成為當?shù)刈顕乐氐乃静『5]。稻黃單胞菌屬水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）為水稻白葉枯病的病原細菌。史波等[6]用人工接種方法鑒定了云南、吉林、浙江等6 省75 個水稻主栽品種對我國白葉枯病菌9 個小種（R1～R9）的抗性，發(fā)現(xiàn)云南省主栽品種抗性弱、抗譜窄，只對其中3 個小種有抗性，在高海拔粳稻生產(chǎn)上使用的粳稻品種鳳稻15 號、楚粳24 號和鳳稻17 號等受害嚴重。采用抗病品種是防治水稻白葉枯病最經(jīng)濟有效的方式之一。弄清各地白葉枯病菌的致病類型，分析水稻主栽品種對白葉枯病菌的抗性情況，是有效利用抗病品種防治病害的基礎。陳深等[7]對采集自華南地區(qū)不同生態(tài)稻區(qū)的150 個白葉枯病菌株進行致病性檢測，發(fā)現(xiàn)V、IV致病型和R8、R5 小種為華南稻區(qū)優(yōu)勢種群，IX 致病型毒性最強且發(fā)展快；強致病菌系V 型已成為華南優(yōu)勢致病菌系。云南具有豐富的稻種資源，不同海拔稻區(qū)水稻白葉枯病菌群體毒性、致病型組成和類型復雜多樣，這可能與云南的地理條件有關[8-10]。云南高原粳稻區(qū)水稻白葉枯病菌的致病型種類已由2003年的10 種不斷發(fā)生變異，增加了許多新的致病型[5，11-12]。和建平等[13]采用3 套不同的鑒別品種對新采集的云南高原粳稻區(qū)的白葉枯病菌的致病型進行鑒定，發(fā)現(xiàn)少了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ7 種致病型，出現(xiàn)另外7 種新致病型。在長期的進化過程中，菌株致病力形成了專化性，所以許多抗病基因都只能對白葉枯病菌的部分菌系起作用，呈現(xiàn)出不同的菌株致病力和品種的抗性差異。本研究通過分別利用余騰瓊等[5，15-16]確定的3 套鑒別品種，對采集分離自云南省內(nèi)海拔1 837 m 以上粳稻區(qū)的32份白葉枯病菌株進行菌株致病力差異分析研究，剖析云南高海拔粳稻區(qū)白葉枯病菌的致病力與海拔高度、經(jīng)緯度、采集品種類型的相關性，以及致病型與品種抗性的關系，以為云南高海拔粳稻區(qū)水稻抗病育種和生產(chǎn)提供理論指導。

表1 32 份菌株及其采集病葉的品種、種植地、海拔

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究供試菌株均由本實驗室2009年采集自11個不同水稻品種上分離獲得的32 份菌株，采集后由本實驗室保存。菌株來自8 個采集地6 個海拔點（1 837～2 350 m），具體見表1。

1.2 鑒別品種及種植方法

以余騰瓊等[5，15-16]構(gòu)建的3 套共15 份鑒別品種為材料。余騰瓊等鑒別品種為毫糯揚、TN1、黃玉、珍珠矮、IR26、南粳33 和金南風，方中達等鑒別品種為金剛30、Tetep、南粳15、Java14、IR26，許志剛等鑒別品種為金剛30、IRBB14、IRBB3、IRBB4、Java14、IRBB5。

將上述15 個鑒別品種播種于云南省西雙版納州農(nóng)業(yè)科學研究所嘎灑鎮(zhèn)試驗田，單行種植，10 株/行，株行距15 cm×20 cm，單本種植。肥水管理同當?shù)爻Ｒ?guī)管理，防蟲不防病。

1.3 接種方法

采用剪葉接種法。接種前用PSA 培養(yǎng)基復壯菌株，28 ℃培養(yǎng)72 h，用無菌蒸餾水洗下菌苔，再用麥法蘭分度計比濁法配成濃度為6×108cfu/mL 的菌液。在水稻孕穗期，于15∶00 后接種，在菌液配制后3 h 內(nèi)完成接種。接種時每個品種選取上部完全展開葉片，葉片長度短于20 cm 的，剪去2～3 cm；長于20 cm 的，剪去4～5 cm[17]。

1.4 分級標準和方法

接種21 d 后進行調(diào)查，每個材料調(diào)查10 張接種葉片，計算平均病斑長度，根據(jù)平均病斑長度進行分級。分級標準：平均病斑長度小于或等于6.0 cm 為抗病（R）；大于6.0 cm 為感病（S）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

品種感病率是指某個鑒別品種上致病性菌株數(shù)占總參試菌株數(shù)的百分比；菌株致病率是指該菌株接種后導致感病的品種數(shù)占總供試品種數(shù)的百分比。根據(jù)致病力的分級結(jié)果，計算致病型頻率（致病類型的數(shù)量／總菌株數(shù)×100%）。用SPSS17.1 軟件中Pearson 相關性分析方法分析菌株致病率、致病型頻率分別與海拔、地理距離、采集品種推廣面積等的相關性。

采用系統(tǒng)聚類分析中的最短距離法計算各地區(qū)水稻白葉枯病菌群體間致病力的歐氏距離。根據(jù)病樣采集點的地理坐標計算不同地區(qū)群體間的地理距離，以Mantel 測驗對各地區(qū)水稻白葉枯病菌群體間致病力的歐氏距離與地理距離間的相關性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南高原粳稻白葉枯病菌的致病力差異分析

32 個供試菌株的致病率變幅為0～73.33%。采集自劍川縣的18 個菌株平均致病率為32.59%，楚雄州6個菌株平均致病率為53.33%，麗江市8 個菌株平均致病率為39.17%，劍川縣的菌株致病力最弱。在楚粳28號上所采集的4 個菌株平均致病率最高為55.00%，致病力最強；致病力最弱的為劍粳3 號上的8 個菌株，平均致病率為29.17%。單個毒性最強的為楚粳28 號和楚粳26 號上的菌株CX28-3、CX30-1，致病率達73.33%；毒性最弱的為劍粳3 號上的菌株JC12-2，致病率為0。

圖1 15 個鑒別品種的感病率表現(xiàn)

采集自不同水稻品種的有些菌株不僅致病率相同，而且致病型也相同。如：同一采集地楚雄州姚安縣舊城村楚粳26 號上的菌株CX30-1 與楚粳28 號的菌株CX28-3 致病率均為73.30%，致病型同為RSSSSSS型（余騰瓊鑒別品種，下同）、SRSSS 型（方中達鑒別品種，下同）、SRSRSS 型（許志剛鑒別品種，下同）；大理州劍川縣金華鎮(zhèn)中登村的劍粳3 號上的菌株JC2-2 與花谷上的菌株JC3-1 致病率均為46.67%，致病型同為Ⅹ型、Ⅵ型、C1 型；大理州劍川縣劍粳3 號的菌株JC1-1與麗江市玉龍縣楚粳26 號上的菌株LJ17-1 及LJ17-2致病率均為20.00%，致病型同為RRRSRSS 型、0 型、0型；大理州劍川縣的劍粳6 號上菌株JC6-1 與大理州劍川縣劍粳3 號上的菌株JC12-1，致病率為13.30%，致病型同為Ⅳ型、0 型、0 型。采集自同一水稻品種的菌株的致病率和致病型都相同，如分離自楚雄州姚安縣舊城村云粳19 號上的菌株CX29-1 與CX29-3，致病率為33.33%，致病型同為RRRSRSS 型、Ⅰ型、SRSRRR型；麗江市玉龍縣大新鄉(xiāng)保夫洛村的楚粳28 號上菌株LJ18-1 與LJ19-1 致病率均為33.33%，致病型同為Ⅹ型、Ⅶ型、SRRRSR 型。這些致病率和致病型一致的菌株很可能為同一菌系。

2.2 鑒別材料對參試菌株的抗性反應

15 個鑒別材料對菌株表現(xiàn)出了不同的抗感性。如圖1 所示，毫糯揚、IRBB14（Xa-14）和IRBB4（Xa-4）對所有菌株表現(xiàn)高抗，沒有供試菌株使其感病；Tetep（Xa-2，Xa-16）也表現(xiàn)出高抗，只有1 個菌株能使其感病；IRBB5（xa-5）有4 個菌株使其感病，品種感病率12.50%；南粳33 感病率最高，達到了93.75%，其次為珍珠矮、金南風和金剛30，品種感病率都在70.00%以上，這4 個品種較為感病。TN1（Xa14）、黃玉（Xa1，Xa12）和IRBB3（Xa3）的感病率較為接近，分別為43.75%、43.75%和40.63%。

2.3 水稻白葉枯病菌株致病力分化與地理區(qū)域的關系

從病菌在鑒別品種上產(chǎn)生的平均病斑長度和致病率來看，病菌采集地海拔高度與病菌的病斑長度不相關，相關系數(shù)r=-0.770（p=0.073＞0.05）；同樣，病菌采集地的海拔高度與病菌的平均致病率的相關性也不顯著，r=-0.691（p=0.058＞0.05）（表2）。由此看出，采集自高海拔粳稻區(qū)的白葉枯病菌的病斑長度和致病率均與海拔高低沒有相關性。

從病菌在3 套鑒別品種上反應的致病型來看，病菌采集海拔與白葉枯病菌的致病型頻率之間相關性不顯著，相關系數(shù)r=0.763，p＞0.05（表2）。8 個采集點粳稻白葉枯病菌群體間的致病力歐氏距離為0.00～4.164（表3）。對致病力的歐氏距離矩陣與相對應的地理距離矩陣進行Mantel 測驗，數(shù)據(jù)點呈上升趨勢，相關系數(shù)r=0.355（P=0.034＜0.05）（圖2），說明菌株間的致病力分化與地理距離相關性顯著，有96.6%的致病力變異可以由地理距離解釋，3.4%的致病力變異是由其他因素決定的（見表3）。

2.4 來源于不同品種的菌株致病力與品種推廣面積的關系

筆者采集白葉枯病菌株的11 個云南水稻品種，主要適宜在1 500～2 400 m 的高海拔地區(qū)種植。據(jù)資料統(tǒng)計，楚粳28 號2009年在云南省推廣面積12.44 萬hm2，采集自楚粳28 號的白葉枯病菌株平均致病率為56.67%，為最高的菌株致病率；劍粳3 號2009年在劍川縣的種植面積達0.77 萬hm2，采集的白葉枯病菌平均致病率為29.17%，為菌株致病率最低值（表4）。水稻品種的種植面積與分離自各品種的病菌致病率呈極顯著相關，相關系數(shù)r=0.730（p=0.001＜0.05）。由此可見，云南省高海拔粳稻區(qū)水稻品種，種植面積越大，從其上采集的白葉枯病菌株致病率越高，反之亦然。

從白葉枯病菌株致病類型和采集品種面積的關系來看，沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性，相關系數(shù)r=-0.470，p=0.145＞0.05，因此，不同水稻品種的白葉枯病菌株致病類型頻率與采集品種面積大小沒有相關性。

3 結(jié)論與討論

表2 采集自不同海拔和經(jīng)緯度的菌株群體平均病斑長度、平均致病率及致病型頻率

表3 水稻白葉枯病菌群體間致病力的歐氏距離（對角線以下）與地理距離（km，對角線以上）

圖2 水稻白葉病菌群體的致病力歐氏距離與地理距離間的相關性

云南稻區(qū)因其獨特的地理環(huán)境和多變、立體的氣候，再加上豐富的稻種資源，各海拔區(qū)域種植的水稻品種有差異，水稻白葉枯病菌與水稻在長期的互作過程中，導致云南稻區(qū)白葉枯病菌生理小種組成十分復雜，在往年實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)新的致病型不斷出現(xiàn)[5，13-14]。云南白葉枯病菌遺傳多樣性也明顯高于國內(nèi)其他省份，且存在顯著差異，其中以中海拔稻區(qū)最高，低海拔稻區(qū)次之，高海拔稻區(qū)最低[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，云南高原粳稻白葉枯病菌株，在不同水稻品種和不同海拔區(qū)域采集的菌株品種感病率和菌株致病率存在差異，致病力最強的菌株為楚雄州的菌株CX28-3 和CX30-1，致病率為73.33%；最弱的為大理州劍川縣的菌株JC12-2，致病率為0；即使來自同一地區(qū)同一品種上的菌株致病力也不同。在高海拔粳稻區(qū)，菌株的致病力分化與采集地的海拔高度無關，卻與地理距離、采集品種的推廣面積相關；采集自不同水稻品種的部分菌株致病率一致，但菌株致病型則不同。在不同地區(qū)間和同一地區(qū)菌株致病力分化與采集地海拔不相關，但與經(jīng)緯度（地理距離）顯著相關，這與李成云等報道的云南白葉枯病菌株致病力與海拔高度相關的結(jié)果不一致[19]，表明云南高海拔粳稻白葉枯病菌的特殊性。但有趣的是，不同地點不同品種上采集的一些菌株的致病率和致病型都一致，但是否為同一個菌株，需要通過下一步菌株的基因組測序才能確定，其形成原因也有待繼續(xù)研究。說明云南稻區(qū)白葉枯病菌生理小種組成具有復雜性和多樣性[18-20]。本研究中，高原粳稻白葉枯病菌株致病力強弱與采集品種的面積大小呈顯著相關，因此，我們認為同一地區(qū)內(nèi)應交替輪換種植多個水稻品種，盡量避免單一水稻品種的大面積種植，才能有效控制強致病力的水稻白葉枯病菌導致的病害大流行和大爆發(fā)。同時，我們應加強對云南高原白葉枯病菌變異機制的深入研究，探索其致病力分化與水稻的協(xié)同進化關系，才能進一步對水稻白葉枯病進行有效防控。

表4 分離自不同品種的菌株致病型頻率及采集品種推廣種植面積

我國對白葉枯病抗性稻種資源篩選進行了廣泛的研究。王明明等[22]采用我國和菲律賓的6 個Xoo 代表菌株，評價了來源于我國26 個省份的174 份水稻微核心種質(zhì)資源對白葉枯病的抗性，發(fā)現(xiàn)6 個粳稻品種（包括云南的雞血糯）和7 個秈稻品種對2 個或2 個以上的菌株具有抗性[21]。余騰瓊等[22]鑒定出云南省不同種植生態(tài)區(qū)的186 份地方稻抗性材料和22 個野生稻抗性居群。海南省25 個水稻白葉枯病菌生理小種，僅有含xa5、Xa7、Xa23、Xa27 基因的鑒別品種對它們有抗性[23]。東北三省的121 個白葉枯病菌分屬于6 個小種，含Xa2、xa5、Xa7、Xa23、Xa27 的鑒別寄主對它們有抗性[24]。本研究中15 份水稻鑒別品種對32 個菌株表現(xiàn)出了不同的抗感性，含抗性基因xa5 的IRBB5 抗性較強，只有5 個菌株能使其感病，說明xa5 這個基因從10年前到現(xiàn)在都還能在水稻生產(chǎn)上保持抗白葉枯病的特性，這與前人的對xa5 基因抗性研究相似[11，25-26]，值得推廣利用。本研究還發(fā)現(xiàn)含抗性基因Xa2 和Xa16 的Tetep、含Xa4 的IRBB4 和毫糯揚對32 個參試菌株都表現(xiàn)高抗，本實驗室近期將毫糯揚抗性基因初步定位于11 號染色體的1.2 cM 的區(qū)間內(nèi)，與其他已知的13個抗白葉枯病基因不同，該基因在云南高海拔粳稻區(qū)具有較大的開發(fā)和利用價值。另外，IRBB14 和TN1 同含抗性基因Xa14，IRBB14 高抗，而TN1 有14 個菌株能使其感病，說明IRBB14 中可能還含有其他抗性基因。而姬廣海等[27]對云南水稻白葉枯病菌115 份供試菌株在16 個水稻品種上的致病性進行鑒定，41 個菌株使IRBB14 品種致病，69 個菌株使IRBB4 品種致病。這與本研究的結(jié)果不同，說明云南高原粳稻白葉枯病菌的致病力隨時間發(fā)生了變化。聚合多個抗性基因的品種一般對白葉枯病表現(xiàn)為抗，但在本研究中只有Tetep 表現(xiàn)出高抗，黃玉（Xa1，Xa12）和Java14（Xa1，Xa3，Xa12）都表現(xiàn)出了較高的感病性，這說明現(xiàn)在云南高原粳稻白葉枯病菌開始出現(xiàn)了能克服含Xa1，Xa3 和Xa12 基因的新小種。鑒別品種毫糯揚、IRBB14（Xa14）、IRBB4（Xa4）和Tetep（Xa2，Xa16）表現(xiàn)出較好抗性。本研究所用的鑒別品種由于抗性基因是已知的，鑒定結(jié)果也能較好地反應出病菌致病性的差異，對云南高原粳稻區(qū)水稻白葉枯病抗性基因的布局具有較大的參考價值。