云南藥用野生稻幼穗離體培養研究

王玲仙 王波 陳越 付堅 鐘巧芳 陳玲 丁明亮 趙才美 雷涌濤 程在全*

（1 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，昆明650205；2 云南省農業科學院糧食作物研究所，昆明650205；3 云南大學生命科學學院，昆明650091；第一作者：2913380597@qq.com；*通訊作者：czquan-99@163.com）

藥用野生稻（Oryza officinalis Wall. ex watt）為多年生禾本科植物，長期處于野生狀態，經受各種災害和地理生態因素的作用，形成了各種抗性和耐受不良環境等優異性狀，是天然的基因庫[1]，具有大穗、寬葉片、粗莖稈等農藝性狀，為普通水稻遺傳改良提供了重要物質基礎。植物愈傷誘導與分化受到多種因素的影響，如：基因型、外植體選擇、培養基類型以及它們之間的互作[2]。盡快發掘和利用有利基因，必須建立野生稻高效快繁綠苗培養體系，過去不同學者對野生稻提高綠苗分化率方法上曾做過一些研究[3-5]。本文利用藥用野生稻幼穗，重復實驗，多組合激素配比篩選出愈傷誘導培養、分化培養和生根培養的培養基。短期內實現遺傳背景一致的藥用野生稻材料規模化生產，滿足以大量藥用野生稻為實驗材料進行抗性基因和新種質育種研究的需要，為品種資源保存和育種苗提供足夠保障。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

1.1.1 樣品來源和采集

樣品來源于云南省孟定縣，采集當年藥用野生稻第二次枝梗原基和穎花原基分化期的幼穗。

1.1.2 幼穗前處理和滅菌處理

將采集的幼穗用保鮮膜包裹好，置于4℃冰箱保鮮層中，低溫前處理3～5 d 后將幼穗取出，用70%酒精表面滅菌1 min，再用0.1%的氯化汞滅菌12 min，無菌水清洗6～7 遍，吸水紙吸干多余水分，待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 幼穗接種預培養

將幼穗剝出，接入不添加激素培養基上進行幼穗預培養，20～35 d 后幼穗萌動出現透明白點，到透明白點增多，待轉接。

1.2.2 愈傷組織誘導培養

將增多的透明白點轉接到2,4-D 濃度為1.0～10.0 mg/L 的愈傷誘導培養基上進行愈傷誘導培養，每組接種30～35 個萌發白點，35 d 后，愈傷呈透明顆粒狀，待轉接到增殖培養基中進行增殖培養。

1.2.3 愈傷組織增殖培養

當愈傷長成膨松透明顆粒時，轉接到2,4-D 濃度為4.0 mg/L 增殖培養基中進行60 d 增殖培養，30 d 更換1 次培養基，增殖愈傷數量增多時，待轉接到繼代培養基中進行繼代培養。

1.2.4 愈傷繼代培養

將數量增多的增殖愈傷轉接到2,4-D 濃度為2.0 mg/L 中進行繼代培養3 次，每30 d 換1 次培養基，直到長出小芽，待轉接進行分化培養；愈傷預培養、誘導、增殖和繼代培養，添加培養材料和培養基為：N6、植物凝膠2.8 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH 值5.8；愈傷誘導、增殖和繼代培養條件為：28℃的人工氣候箱中進行暗培養。幼穗接種預培養條件為：光照強度3 000 lx 培養20 d，再下調至1 000 lx 培養35 d。

表1 不同2,4-D 濃度條件下誘導愈傷組織的生長情況

1.2.5 愈傷組織分化成小苗

將愈傷長出的小芽接入6-BA 濃度為0.1～3.0 mg/L 分化培養基進行分化培養，每組接種30～35 個，30 d后，轉接到6-BA 濃度為0.5 mg/L 增殖培養基和6-BA濃度為0.2 mg/L 的繼代培養基中進行增殖和繼代各培養30 d、60 d 后，長出小苗進行壯苗培養。

1.2.6 分化壯苗培養

將繼代小苗接種在6-BA 濃度為0.3 mg/L 的壯苗培養基上進行壯苗培養32 d，小苗長至3～4 cm 時，莖稈增粗，葉色油綠，進行生根培養。分化、增殖、繼代、壯苗培養基添加激素和培養基為：N6、NAA 0.3 mg/L、ZT 2.0 mg/L、KT 3.0 mg/L；壯苗培養基另外添加TDZ 3.0 mg/L；添加培養材料為：植物凝膠2.8 g/L、蔗糖30 g/L，pH 值5.8；培養條件為：培養溫度28℃，光照強度3 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.7 生根培養

將3～4 cm 的壯苗分別接在1/2 N6、NAA 濃度為0.1～2.0 mg/L 的生根培養基上進行生根培養，每組接種10～16 苗，15 d 后，根芽露白、根芽長出，28～36 d 統計主根、須根長、根粗和根數，觀察植株生長情況。當生根苗長至7～10 cm 時進行苗鍛煉培養。

1.2.8 苗鍛煉培養

將長至7～10 cm 的生根苗揭膜加水培養，3 d 后將苗從培養基中取出，自來水沖洗干凈根部培養基后加水淹沒根部。

生根添加培養材料和培養基為：1/2 N6、植物凝膠2.8 g/L、蔗糖15.0 g /L，pH 值5.8；培養條件為：生根和苗鍛煉培養溫度28 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.9 苗的溫室定植

苗鍛煉培養7 d，將苗從培養箱中取出，單苗移栽在裝有珍珠巖、泥炭、蛭石（按3∶2∶1 比例混勻）的盆中進行定植生長，水淹沒根部，培養1 周后，將水放干，定根生長7 d，再加水進行培養。

1.2.10 苗的田間移栽和管理

定根苗定植生長40 d 后，將苗移栽到大田，注意有效固根，中期保證水、保肥，注意病蟲害的防治，生長中后期進行追施尿素肥1 次，直到種子成熟。

2 結果與分析

2.1 幼穗前處理和幼穗接種預培養

幼穗經過4℃低溫前處理3～5 d，利于幼穗萌發。剝離的幼穗接入零培養基上，先強光，再弱關進行幼穗預培養，20 d 后幼穗萌動出現透明白點，繼續培養35 d，透明白點增多，有少許白點增大。

2.2 不同2,4-D 濃度對誘導愈傷組織的影響

由表1 可見，設置10 個組合不同濃度激素的N6愈傷誘導培養基，35 d 后，愈傷呈透明顆粒狀，在愈傷組織上出現粒狀結構的胚狀體，與舒理慧等[6]報道類似，此時2,4-D 濃度為2.0 mg/L 的培養基愈傷誘導出愈率最高，達100%（圖1）。接入2,4-D 濃度為4.0 mg/L的培養基愈傷，經過60 d 的增殖培養，愈傷顆粒膨大，愈傷數量增多，出愈率在96.7%。增殖愈傷在2,4-D 濃度為3.0 mg/L 的培養基繼代培養90 d，愈傷長至1.5～2.0 cm，愈傷透明、膨松，顏色由原來黃綠色變成深綠緊實顆粒愈傷。當2,4-D 濃度為12.0 mg/L 時，愈傷出愈最差，只達到18.8%，褐化嚴重。

表2 不同6-BA 濃度條件下再生苗的分化生長情況

圖1 藥用野生稻愈傷誘導培養

圖2 藥用野生稻分化培養

2.3 不同6-BA 濃度對再生苗分化生長的影響

設置10 個組合不同濃度激素的N6 分化培養基，經過90 d 的分化、增殖和繼代培養，從表2 可以看出，愈傷在濃度為6-BA 0.1～1.0 mg/L 的分化培養基中都能夠分化出苗，成苗率在3.0%～22.9%之間，最佳的分化培養基濃度為6-BA 0.4 mg/L，成苗率達到22.9 %（圖2）；其次濃度為6-BA 0.5 mg/L 時，成苗率達到15.6%，叢芽增多，此培養基作增殖培養最好。當濃度為6-BA 1.0 mg/L 時，成苗率低，只達到3.0%；小苗生長緩慢、無循環叢芽長出，用于保種、繼代培養最適宜；以濃度為6-BA 0.3 mg/L 添加TDZ 3.0 mg/L 作為壯苗培養較好，經過壯苗培養的小苗健壯，油綠。在濃度為6-BA 2.0～3.0 mg/L 的培養基中未分化出綠苗。從10 個組合培養基來看都產生白化苗，最高的白化苗占接種數的25.7%。污染數最高占接種數的17.1%。

2.4 不同NAA 濃度對生根苗生長的影響

設置10 個組合不同濃度激素的1/2 N6 生根培養基，從表3 可以看出，當NAA 的濃度為0.1～0.2 mg/L時，藥用野生稻幼穗的平均主根長及生根率均隨著激素的增高而增高，主根、須根增粗；NAA 濃度在0.2 mg/L 時，須根最多，生根率最高，達到90.9%（圖3）；當NAA 的濃度為0.3～0.9 mg/L 時，藥用野生稻幼穗的生根率隨著激素濃度的增高而逐漸下降，平均主根長也隨之降低，平均根粗和須根數量無規律變化，須根根系分蘗強，根系發達；當NAA 的濃度為1.0 mg/L 時，生根率最差，只達到7.1%，平均根長最短、根粗最細。

2.5 苗鍛煉及移栽管理

組培苗和自然生長苗生存環境存在著很大差異，組培苗由室內環境逐漸過渡到室外，生長環境由無菌狀態變成有菌狀態，培養溫度和光照條件同樣發生了改變。本實驗結果表明，生根苗從揭膜、適應常溫、溫室定植到田間移栽，經歷57 d 循序漸進的過程，苗的成活率達到97.0%。

3 討論

3.1 2,4-D 濃度對藥用野生稻幼穗愈傷組織誘導的影響

在藥用野生稻幼穗離體培養中，形成愈傷組織和胚性愈傷組織是離體培養中的重要環節。植物生長素是影響水稻愈傷組織誘導的關鍵因素之一，2,4-D 是誘導水稻組織產生愈傷組織不可缺少的關鍵激素成分[7-8]。本實驗結果表明，幼穗接種預培養后，透明白點增多，應盡快接入誘導培養基中進行愈傷誘導培養。當2,4-D 濃度＜1.0 mg/L 或＞6.0 mg/L 時都不利于藥用野生稻幼穗愈傷和胚性愈傷組織的形成。在幼穗的不同發育時期，都有著不同的生理狀態與形態發生規律，其愈傷組織誘導率都會存在一定的差異[9]。本實驗發現，在誘導愈傷時，愈傷大約0.3 cm 時會長出細根，說明野生稻根系是比較發達的，愈傷繼代幾次必須觀察愈傷由透明膨松愈傷變成黃綠凸起的緊實顆粒愈傷，此時愈傷用于分化最佳。

表3 不同激素濃度對生根苗的生長情況

圖3 藥用野生稻生根培養

3.2 生長調節劑對緊穗野生稻幼穗分化成苗的影響

植物生長調節劑是影響愈傷組織再分化的關鍵性因素之一，細胞分裂素在組織培養中促進細胞分裂和分化，可促進植物細胞的分裂和不定芽的形成，打破頂端優勢形成叢生芽，有利于芽的增殖和繼代培養[10-12]。6-BA 是誘導水稻愈傷組織再生植株時常用的細胞分裂素[13]。周玲艷等[14-15]認為，6-BA 有利于水稻愈傷組織的分化，選擇生長素NAA 與一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的產生，也是相符合的[16]。在分化培養基中添加KT、ZT 促進成苗而不利于分化[17]。本實驗中，與6-BA 搭配使用，芽分化增多，苗分化率明顯得到提高。人們發現TDZ 在芽分化、愈傷組織誘導、體胚發生、生根等方面都表現出很強的活性[18]。在藥用野生稻分化壯苗培養基中添加TDZ，并與多激素配比，也有利于分化率的提高和壯苗培養。本實驗得出，利用生長素和幾種細胞分裂素適合的比例聯合使用，促進了愈傷綠色凸起增多、叢生芽和新愈傷長出，成苗率得到提高，是藥用野生稻幼穗分化的最佳選擇。不同品種材料在選擇培養基及激素搭配和比例配比時，必須對癥下藥，方可見效，以免適得其反。

3.3 生長調節劑對緊穗野生稻幼穗生根苗的影響

眾所周知，生長素NAA 其主要作用是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產生以及試管苗的生根。NAA 濃度0.2 mg/L 時，是最佳的生根培養基，生根率達到90.9%。促進了主根的增長，增多須根，須根分枝強，有利于根系吸收水分和養分。

3.4 苗鍛煉及移栽管理

苗的鍛煉及大田移栽，從揭膜、放置常溫、溫室定植到田間移栽經歷57 d 這樣一個循序漸進的過程，苗的成活率可以達到97.0%。

4 結論

本研究對藥用野生稻幼穗離體培養、培養條件、培養方法進行了有效改進；根據不同的生長需要，篩選出適合藥用野生稻幼穗愈傷誘導培養、分化培養、生根培養的培養基。4℃低溫前處理和幼穗預培養有利于白點萌發的增多和增大，更利于愈傷的出愈率，優質的愈傷提高了藥用野生稻幼穗的分化率，高質量的分化率又獲得了健壯的藥用野生稻幼穗生根苗，實現了建立藥用野生稻幼穗離體保存庫關鍵技術的突破。