水稻蛋白組分鑒定方法及其在食味品質評價上的應用

蘭靜 賈雯靖 孫向東 趙琳 金海濤 王冰 張瑞英*

（1 黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，哈爾濱150086；2 農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室，哈爾濱150086；第一作者：15004681709@163.com；*通訊作者：zhruiying@163.com）

水稻是人類的主要糧食作物，尤其亞洲國家（如中國、日本、南亞等國家）多以稻米為主食。在亞洲地區，大米為當地人口提供高達50%以上的飲食能量需求，占有極高的比例[1-2]。近年來，隨著生活水平的提高，人們對稻米的追求逐漸由產量轉至食味品質[3-4]。影響稻米食味的主要因素是蛋白質含量及直鏈淀粉含量等[5]。稻米中的蛋白質是公認的最優植物蛋白[6-7]，具有降低膽固醇和降低體脂等作用[8-9]。蛋白質作為稻米品質的主要性狀，是稻米品質改良不可忽視的重要因子，然而其相關研究還較為薄弱。水稻蛋白質按照功能劃分，可分為貯藏蛋白和結構蛋白。水稻種子中絕大多數的蛋白質是貯藏蛋白，結構蛋白是維持種子細胞正常代謝的蛋白，相對較少。水稻貯藏蛋白質主要存在于胚乳，按溶解性可分為球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[10]。谷蛋白是稻米中重要的貯藏蛋白[11-12]，其含量占種子總蛋白的80%左右[13]，它是稻米中僅次于淀粉易于被人體消化吸收的主要胚乳成分[14]。醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白的占比則分別為1%～5%、2%～10%、2%～5%[15-17]。我國稻米產量居世界第一，但由于稻米品質以及品質檢測技術落后等原因，我國的稻米在國際市場上缺乏競爭力[18-19]。關于蛋白質與稻米品質之間的關系，國內外已有很多報道[20]，但主要集中在表觀蛋白質含量與食味品質之間的關系變化上。如有研究表明，稻米的蛋白質含量越低，則其食味評分越高[21]。WAKAMATSU 等[22-23]通過設置不同的氮肥處理以增加籽粒蛋白質含量，結果表明，食味較好的稻米蛋白質含量在6%～7%，大于7%則食味會降低。稻米食味值與谷蛋白的含量呈不顯著的負相關，說明隨著谷蛋白含量的增加，稻米的食味品質有下降趨勢[24]。清蛋白是與稻米食味品質優劣關系更密切的蛋白，目前對稻米清蛋白的研究甚少。馬建[25]研究了幾種電泳技術在水稻品種鑒定上的應用，并未與食味建立相關關系。大多數對蛋白質與食味品質的研究主要關注點是氮素方面[26]。目前，水稻蛋白電泳技術僅應用于品種鑒定方面，在稻米食味品質研究中的應用較少。且對蛋白質含量與水稻食味品質的關系研究僅停留在表觀蛋白質含量上。因此將水稻蛋白質電泳技術應用于食味品質評價中，有助于水稻品質改良的研究，為提高稻米品質奠定基礎。本文在前人研究基礎上，改進并優化了水稻谷蛋白和清蛋白電泳方法，并應用于稻米食味品質研究中，從蛋白質組分分析稻米食味品質，為優質水稻早期世代材料篩選及品質改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 水稻品種來源

以粗蛋白質含量接近、食味評分不同的水稻品種龍粳香1 號、長粒香2 號、墾粳12、龍粳29、五優稻、高粱稻為試驗材料，具體見表1。其中，長粒香2 號分別來源于同江市和富錦市。

表1 不同來源水稻品種蛋白質含量及食味評分

圖1 不同谷蛋白提取方法電泳圖譜比較

1.1.2 化學試劑

所有試劑都是國產或進口分析純，用蒸餾水配制有關溶液，電泳儀和電泳槽型號為BIO-RAD Power Pac，產地新加坡。

1.2 試驗方法

1.2.1 大米粉制備

稻米經自然風干后，稱取100 g，先用糙米機碾成糙米，再將糙米通過精米機碾成精米。精米經磨粉機碾磨成粉，于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 水稻蛋白提取

谷蛋白：參考馬健[25]的方法并進行了優化。稱取40 g 大米粉于燒杯中，加入40 mL 蒸餾水浸泡。攪拌至混勻，靜置1 h，手動攪拌15 min，4 000 r/min 的轉速離心5 min，棄上清。沉淀加入40 mL 0.03 mol/L NaoH（aq），手動攪拌18 min，4 000 r/min 的轉速離心10 min，取上清，調pH 值至4.8，再用4 000 r/min 轉速離心10 min。收集沉淀，水洗3 次，得到的谷蛋白自然陰干，于-20℃條件下保存備用。

清蛋白：參考楊靜等[24]的方法并進行了優化。提取清蛋白的溶劑為蒸餾水。大米粉與蒸餾水比為1∶1，搖床振蕩提取2 h。15000r/min 的轉速離心5 min。取上清于2 mL 離心管內，于-20°C 條件下保存備用。

1.2.3 凝膠配制

1.2.2.1 分離膠的配制 （1）27.23 g Trizma base 溶解于80 mL 的蒸餾水中，用鹽酸調pH 值至8.8，蒸餾水定容至150 mL。（2）量取步驟1 中的溶液25 mL，加入40 mL 的30% Monomer Sol'n、1 mL 10%SDS、33.5 mL的蒸餾水混勻，4°C 保存備用。（3）量取步驟2 中的溶液9.95 mL，加入50 uL 10% 過硫酸銨，5 uL 的TEMED，混勻，灌入膠板中。上層加入蒸餾水封口。等待分離膠凝固。

1.2.2.2 濃縮膠的配制 （1）6.0 g Trizma base 溶解于60 mL 的蒸餾水中，用鹽酸調pH 值至6.8，蒸餾水定容至100 mL。（2）量取步驟1 中的溶液25 mL，加入13 mL 的30% Monomer Sol’n，0.5 mL 10%SDS，61 mL 的蒸餾水混勻，4℃保存備用。（3）量取步驟2 中的溶液10 mL，加入50 uL 10% 過硫酸銨、10 uL 的TEMED 混勻。待分離膠凝固，倒出表面的水層，將配制好的濃縮膠灌入膠板中。然后插入梳子，等待凝固。

1.2.4 電泳

蛋白提取液的配制：0.125 mol/L Tris-Hcl（pH 值6.8）、4% SDS、20%甘油、4 mol/L 脲素、5% 巰基乙醇。

谷蛋白進樣量為7 μL，清蛋白進樣量為10 μL。電泳開始時，恒定電壓為100V ，當樣品到達分離膠時，電壓降至80V，電泳2.5 h。

1.2.5 蛋白固定

電泳結束，取出凝膠。將凝膠浸入40 mL 的10%三氯乙酸中，搖床振蕩固定蛋白。過夜固定。

1.2.6 染色與脫色

凝膠置于40 mL 考馬斯亮藍R-250 溶液中，搖床染色2 h。然后在冰乙酸、甲醇、水混合溶液（三者比為10∶45∶45）中脫色。

2 結果與分析

2.1 水稻谷蛋白電泳

2.1.1 水稻谷蛋白提取方法的優化

圖1A 是采用文獻中堿提酸沉的方法提取的水稻谷蛋白，即將大米粉以一定的固液比直接浸泡于堿液中，然后進行酸沉。得到的圖譜效果很差，譜帶模糊。圖1B 圖則是進行改進后的谷蛋白圖譜，先用水浸泡大米粉，再加入堿液，酸沉得到谷蛋白。此方法得到的谷蛋白進行電泳圖譜清晰度明顯優于圖1A。但是優化后的圖譜也存在一定問題，如雜帶太多、清晰度稍差等。

因水溶性蛋白干擾，需對谷蛋白的提取方法再次優化。采用先水浸提，通過離心的方式去掉大部分水分，加入堿液，同時降低了堿液的濃度。再經過酸沉、水洗得到谷蛋白，進行電泳試驗，得到的圖譜如圖1 C。該圖譜譜帶分明，清晰度也很好。

2.2.2 水稻谷蛋白電泳上樣量的優化

圖2 不同谷蛋白進樣量電泳圖譜比較

圖3 北方粳稻與南方粳稻谷蛋白電泳圖譜比較

圖4 蛋白質含量相近水稻谷蛋白電泳圖譜比較

圖2 中左邊的圖采用的進樣量為10 uL，發現譜帶不清晰。對進樣量進行了優化，從5～9 uL 之間進行了試驗，結果表明，7 uL 是最適宜的上樣量。

2.2.3 水稻谷蛋白電泳應用

2.2.3.1 北方大米與南方大米樣品谷蛋白電泳差異分析 由圖3 看出，3 個東北大米之間譜帶無差異，4 個來源于江蘇的大米樣品之間譜帶也無差異。但東北大米和江蘇大米的圖譜出現了差異，B3565（南粳9108）在60 kDa 處譜帶缺失。可見，水稻谷蛋白電泳能夠鑒定南方水稻與北方水稻谷蛋白亞基結構差異。

2.2.3.2 蛋白質含量相近的大米樣品谷蛋白電泳差異分析 選取蛋白質含量接近、食味評分相差較大的大米樣品進行谷蛋白電泳圖譜分析，發現樣品蛋白質含量變異幅度為7.70%～7.91%，食味評分變異幅度為71～90 分。由圖4 可知，7 個樣品的譜帶并沒有明顯的差異。

圖5 蛋白質含量相近的水稻清蛋白電泳圖譜比較

2.3 水稻清蛋白電泳

2.3.1 蛋白質含量相近的大米樣品清蛋白電泳差異分析

對蛋白質含量接近、食味評分相差較大的7 個樣品進行清蛋白電泳圖譜分析。從圖5 可以看出，龍粳香1 號水稻樣品譜帶與其他樣品譜帶不同，在70～105 kDa 處出現了譜帶的缺失。在105 kDa 處，長粒香2 號條帶也出現了譜帶的缺失。由表1 看出，這2 個樣品的食味評分很低。譜帶顏色較深的高粱稻，其食味評分最高。龍粳29 和五優稻的譜帶顏色次之，其食味評分也對應下降。

3 討論與結論

按照現有谷蛋白電泳方法進行水稻谷蛋白電泳，發現水稻樣品譜帶重疊無法區分，通過查閱大量資料，經過反復試驗，筆者在蛋白質提取方法、化學試劑用量等方面進行了改進，建立了一種新的谷蛋白電泳方法。采用新的谷蛋白電泳方法對蛋白質含量相近、食味值有差異的水稻樣品進行譜帶分析，發現品種之間譜帶無差異；對北方粳稻與南方粳稻品種進行谷蛋白電泳譜帶分析，發現北方粳稻與南方粳稻品種譜帶有差異，而北方粳稻品種之間或南方粳稻品種之間譜帶差異不大。

目前，有關水稻清蛋白電泳方法研究較少，利用該方法對水稻食味品質進行評價尚未見相關報道。現有研究表明，水稻表觀蛋白質含量越低，米飯食味值越高。本研究對表觀蛋白質含量相近、食味值差異較大的水稻品種進行清蛋白電泳圖譜分析，發現105 kDa 處譜帶缺失，其米飯食味值較低；105 kDa 處譜帶顏色越深，其米飯食味值越高。105 kDa 為水稻食味優質亞基。本研究為初步結果，下一步需通過液相色譜法定量檢測做進一步驗證工作。