吉非替尼聯合125I 放射性粒子治療肺腺癌有效性的動物研究

姚林艷，李超杰，王子寅，單群剛，龐浩鵬，陸 健，貢 桔，王忠敏，劉芬菊

癌癥是世界范圍主要公共衛生問題，根據2018年世界癌癥報告（GLOBOCAN） 的數據顯示，肺癌是最常見的惡性腫瘤，它占總癌癥病例的11.6%，也是癌癥死亡的主要原因，占癌癥總死亡人數的18.4%[1-2]。在肺癌中，非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌總數的80%以上，且大部分患者發現時已發展為不宜手術的Ⅲ、Ⅳ期[3]。因此，晚期NSCLC 的治療傾向于多學科，包括手術、化學療法、放射療法、免疫治療和分子靶向療法等。

放射性粒子可局部直接植入腫瘤組織，通過放射線照射，能夠提供更高腫瘤靶區劑量，殺死腫瘤細胞，達到治療目的[4]。在惡性腫瘤治療方面，國內外已有應用125I 放射性粒子植入治療有效性的報道[5]。然而，在細胞被電離輻射損傷后，會阻礙細胞周期，使細胞有足夠的時間來修復受損的DNA；此外，它在受損細胞中誘導不能修復的細胞凋亡，從而降低基因組的不穩定性并降低細胞突變的可能性。因此，在放射治療過程中，腫瘤細胞可以通過細胞周期阻滯的作用，降低對射線的敏感性，從而降低治療效果[6]。

表皮生長因子受體（EGFR） 是一種受體型酪氨酸激酶，與表皮生長因子（EGF）結合后形成同源或異源二聚體，從而激活細胞內酶，啟動細胞核中的相關基因，增高基因轉錄水平，破壞細胞生長平衡，導致腫瘤的發生和發展。研究表明，EGFR 在很多種惡性腫瘤中存在高表達或異常表達，影響患者的預后[7-9]。EGFR 的表達與放療療效成負相關[10-11]。EGFR 是靶向治療的關鍵，在腫瘤基礎研究中，已證實EGFR 相關抗體及抑制劑可用于腫瘤治療[10，12]。吉非替尼是一種靶向EGFR 的小分子酪氨酸激酶抑制劑，可競爭性抑制配體的結合位點，封閉其活性，從而達到阻斷信號轉導、抑制腫瘤生長的目的[9，13]。

大多數靶向治療主要是靶向惡性癌細胞，很大程度上忽略了腫瘤微環境的影響。NSCLC 中，患者對EGFR 抑制劑產生應答，但是，由于腫瘤微環境的相互作用、旁路激活、靶點擴增或再次突變等因素的影響，最終產生耐藥性[14]。放療和分子靶向治療是NSCLC 的重要治療手段。本研究將抗EGFR治療藥物吉非替尼和125I 放射性粒子聯合應用，觀察吉非替尼和125I 放射性粒子是否具有協同抗腫瘤作用 。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

4～6 周齡的雌性BABL/c 裸鼠24 只，體重約20g（上海交通大學醫學院動物房提供）。放射性粒子活度0.6mCi，生物半衰期為59.6 d 的125I 粒子（上海欣科醫藥有限公司提供）。吉非替尼（gefitinib）[商品名易瑞莎（Iressa）]由英國AstraZeneca提供，劑型：250 mg/片，溶解于5%葡萄糖溶液。穩定表達熒光素酶的A549-luc 細胞（中國科學院提供）。熒光素酶底物（D-luciferin）（北京百靈威科技有限公司）；小動物可見光活體成像系統IVIS Spectrum（Xenogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人肺腺癌A549 細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立和分組 將人肺腺癌A549-luc 細胞1 x 107/mL 接種到裸鼠右側腋窩皮下，每只0.2 mL。隔天觀察移植瘤生長。每3～4 天用游標卡尺測量移植瘤大小，接種20 d 后，當移植瘤成瘤大小8～10 mm時，24 只荷瘤裸鼠隨機分為空白對照組、125I 放射性粒子組，吉非替尼組，吉非替尼聯合125I 放射性粒子組，每組6 只。吉非替尼單藥組：吉非替尼混懸液按0.1 mL/10g 規格灌胃，每天1 次，連續用藥5 周；125I 放射性粒子組：每個移植瘤內置入1 枚0.6 mCi粒子源；聯合治療組：按125I 放射性粒子組及吉非替尼組的劑量聯合給予；對照組： 5%葡萄糖溶液，每天1 次灌胃，用量和用法與吉非替尼治療組相同。全部裸鼠均在末次給藥24 h后，通過頸椎脫位處死。根據公式V=L×W2/2（L 為最長徑，W2為與L 相垂直的橫徑）計算移植瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。剝離皮下腫瘤迅速將腫瘤組織切成多個小組織塊并置于液氮中以備RT-PCR 檢測使用。

1.2.2 活體生物熒光檢測 裸鼠皮下接種A549-luc細胞后，在接種后第3 周進行活體熒光檢測，治療后第1、2、3 周應用IVIS-Spectrum 系統檢測皮下移植瘤的生物發光信號。檢測時，每只裸鼠按照150 mg/kg體重的量腹腔內注射熒光素底物，并在異氟烷麻醉后10～15 min 進行體內成像。成像后，應用系統附帶軟件檢測皮下腫瘤生物發光信號強度。

1.2.3 18 F-FDG Micro-PET/CT 成像 采用Super Nova PET/CT 掃描儀（PINGSENG Healthcare 公司），治療前和治療后1 周分別進行顯像。將麻醉后的裸鼠俯臥位固定在掃描架上，先行CT 檢查（參數為80 kV，0.5 mA），曝光時間為10 min，然后以相同的體位進行PET 采集。通過腹腔注射7.4 MBq18F-FDG 進行PET 顯像，并在注射顯像劑后1 h 進行延遲顯像，持續采集20 min。以3D 模式獲取圖像，重建冠狀、矢狀及橫斷面圖像。以腫瘤最大層面計算最大標準攝取值（SUVmax）和平均標準攝取值（SUVmean ）

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 移植瘤動物模型

共計接種24 只，全部順利成瘤，成瘤率100%。從皮下種植開始至取瘤結束，所有裸鼠均全部存活，均未發現明顯放射誘導損傷。所有植入粒子未見移位、遺失，均成功回收，儲備在鉛盒中進行安全處理。

2.2 抑瘤效應

空白對照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入治療組，治療前的腫瘤體積分別為（282.89±71.32）mm3、（289.51±69.90）mm3、（287.79±32.96）mm3和（287.99±44.19）mm3，4 組中各組間差異無統計學意義（F=0.015，P ＞0.05）；經過4 種不同方法干預后2 周，各組移植瘤體積比較差異有統計學意義（F=6.617，P ＜0.05），從此至治療結束3 個時間點，即第3 至5 周，各組移植瘤體積間比較差異均有統計學意義（F=5.156，8.432，10.305，P＜0.05）。空白對照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯合125I放射性粒子植入治療組治療后的腫瘤體積分別為（1 509.25±709.93） mm3、（840.45±43.35） mm3、（1 052.96±247.42） mm3和（317.34±52.08） mm3，吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組低于其他3 組，差異有統計學意義（F=10.305，P ＜0.05）。治療后，聯合組較125I 放射性粒子組和吉非替尼組差異有統計學意義（P ＜0.05）。如圖1 顯示了裸鼠接受不同方法干預后移植瘤生長曲線。

圖1 4 種不同方法處理下腫瘤體積變化

2.3 裸鼠體重

空白對照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼和吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組治療前裸鼠體重分別為（26.17±1.72）、（26.17±1.33）、（24.83±2.40）和（26.67±1.86）g，差 異 無 統 計學意義（F=1.062，P＞0.05），治療后體重分別為（27.33±4.08）、（26.83±3.12）、（24.50±2.59）和（24.50±2.34）g，差異有無統計學意義（F=1.408，P＞0.05），并均較治療前差異無統計學意義 。

2.4 生物發光成像監測

圖2 125I 放射性粒子聯合吉非替尼組 腫瘤生物熒光強度明顯減弱

人肺腺癌A549-luc 細胞注射BALB/c 裸鼠3W 后，Xenogen IVIS-spectrum 小 動 物 熒 光活體成像儀觀察裸鼠中腫瘤生長情況，腫瘤中熒光光子強度變化。結果顯示裸鼠種植部位可檢測到生物熒光，提示腫瘤發生。空白對照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組治療前腫瘤部位生物發光光子數分別為（209371666.7±32194019.58）、（2 108 666666.7±76 166 519.33）、（188 318333.3±42 959 832.60）和（212 876 666.7±70 366 339.02） P/sec/cm2/sr，差異無統計學意義（F=0.27，P ＞0.05），治療后檢測生物熒光信號，光子數分別為（198 605 000.0±12 976 503.00）、（99 263 333.33 ±49 293 480.57）、（87 419 500.0 ± 24 039 740.21）、（48 433 333.33±14 417 910.62）P/sec/cm2/sr，差異有統計學意義（F=28.975，P ＜0.05），125I 放射性粒子植入組、吉非替尼和吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組差異均較治療前有統計學意義（T=6.392、9.946、6.677，P ＜0.05），吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組低于其他3 組。空白對照組較治療前差異無統計學意義（T=1.189，P ＞0.05）。腫瘤體積大小結果與生物熒光值強弱趨勢基本一致。見圖2、圖3、圖4、圖5（ ①為治療前，②、③、④治療后1 周、2 周、3 周）

2.5 18F-FDG Micro-PET 代謝監測

空白對照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯合125I 放射性粒子植入組的18F-FDG SUVmax 治療前為0.85±0.12、0.85±0.12、0.79±0.05、0.82±0.09，治療后為0.88±0.13、0.77±0.10、0.75±0.19、0.75±0.03，差異無統計學意義（F=1.449、1.604，P ＞0.05）。SUVmean 治療前為0.45±0.06、0.55±0.15、0.52±0.05、0.51±0.08，治 療 后為0.56±0.07、0.54±0.06、0.49±0.12、0.48±0.04，差異無統計學意義（F=1.155、1.604，P ＞0.05）。如圖6 治療前和125I 放射性粒子聯合吉非替尼治療1 周后。

圖3 125I 放射性粒子組 腫瘤生物熒光強度沒有明顯減弱

圖4 吉非替尼組 腫瘤生物熒光強度沒有明顯減弱

圖5 對照組 腫瘤生物熒光強度增強

圖6 治療前和治療1 周后

3 討論

近年來，隨著微創技術的發展，放射性粒子植入在惡性腫瘤的治療中取得了較快進展。125I 是一種合成的核素，半衰期為59.63 d,在衰減時釋放能量，分別為27.4 KeV、35.5 KeV 的X 射線、γ 射線；有效的殺傷半徑范圍是1.0～1.5 cm。目前臨床使用的125I 放射性粒子長徑為（4.50±0.3） mm，直徑為（0.80±0.03） mm；每粒粒子放射性活度在0.5～0.8 mCi[15]。125I 放射活性低、療效高、精確度高，對正常組織的損傷小等特點。通過將放射性粒子置于腫瘤內，釋放出低能γ 射線破壞腫瘤細胞周期，且在殺滅腫瘤細胞中發揮作用[16-17]。DNA 是輻射的主要目標，放射可以使機體內的水分子電離并產生自由基，自由基與生物大分子相互作用，造成組織細胞傷害。

EGFR 是原癌基因Cerb-1（HER-1）表達產物，具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與相應配體結合后，引起特定的酪氨酸殘基自動磷酸化，最終導致細胞增殖和血管生成，其通過信號轉導導致不受控制的細胞生長[18]。EGFR 在很多惡性腫瘤中存在高表達或異常表達，尤其是在NSCLC 中，其陽性率甚至高達80%～85%，而這種高表達狀態是導致NSCLC 放療抵抗的重要因素[11]。吉非替尼是一種EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI），它競爭性地結合于細胞表面Mg-ATP 結合位點上，阻斷其下游的信號轉導通路，使細胞周期停止在G0～G1 交界期，從而抑制細胞周期、促進細胞凋亡、抑制腫瘤增殖和轉移[19-20]。本研究中，4 組裸鼠移植瘤治療后其體積差異具有統計學意義（F=10.305，P ＜0.05），且吉非替尼聯合125I 放射性粒子組治療后腫瘤體積（317.34±52.08） mm3明顯小于其他組的（1 509.25±709.93）、（840.45±43.35）、（1 052.96±247.42） mm3。因此，125I 放射性粒子聯合吉非替尼能夠更有效抑制腫瘤生長，但是具體機制仍需進一步研究。

近年來，分子成像技術得到廣泛應用，可以實現動物腫瘤模型無創、連續、實時地觀察，為腫瘤的分子診斷及治療提供了重要的研究方法[21]，其中生物發光成像可以檢測到動物模型中微小病灶，靈敏度高、安全系數高、沒有放射性危害、操作簡單、定量準確[22]。熒光素酶在ATP 和氧存在的情況下催化熒光素氧化，并在熒光素氧化的過程中，發出生物熒光。使用熒光素酶標記的腫瘤細胞進行小動物體內成像可以更有效地觀察腫瘤的發生和發展，并評估治療效果[23]。本研究中，在動物熒光活體成像儀觀察裸鼠中腫瘤生長情況，治療后檢測生物熒光信號，光子數差異有統計學意義，吉非替尼聯合125I 放射性粒子組低于其他3 組。

18F-FDG（氟脫氧葡萄糖）是最主要的腫瘤顯像劑之一，惡性腫瘤細胞對葡萄糖的需求量大，注射18F-FDG 后，腫瘤病灶部位呈高攝取狀態。因此，18F-FDG PET 顯像為功能顯像。本實驗建立了A549-luc 裸鼠腫瘤模型，結果顯示，治療前與治療后腫瘤部分攝取狀態并沒有明顯變化，SUVmax和SUVmean 前后差異無統計學意義，推測有以下可能：選擇的是人肺癌A549 細胞，制作裸鼠肺腺癌模型，可能存在異質性差異，也可能存在裸鼠體質差異，另外可能實驗尚未探索出可以表達陽性結果的濃度及劑量。在相關文獻中，也并沒有發現應用A549 細胞建成的裸鼠肺腺癌模型，在18F-FDG Micro-PET/CT 成像中相關陽性結果。

實驗中，通過皮下注射A549-luc 細胞建立裸鼠腋下移植瘤模型，采用125I 放射性粒子，吉非替尼，125I 放射性粒子聯合吉非替尼分別作用于裸鼠，測量腫瘤大小，利用生物發光成像技術檢測治療前后裸鼠移植瘤生物發光信號值，隨治療時間的延長，皮下移植瘤的體積增長受到抑制，生物發光信號逐漸降低，結果顯示各治療組均能抑制腫瘤組織生長，而125I 放射性粒子聯合吉非替尼組作用更顯著。兩藥在抑瘤方面具有一定的協同作用。本次實驗各組樣本量較少，具有局限性，研究中對于125I 放射性粒子與吉非替尼聯合作用機制仍未明確，接下來需要加大樣本量研究并進一步探討協同作用機制。