E.coli K-12琥珀酸脫氫酶sdhC基因納米錐的設計及自組裝

周末，劉彥君，佟欣瑞，董延甲，吳欣瑜，王迎香，應明

（1天津理工大學化學化工學院，天津300384；2天津理工大學計算機科學與工程學院，天津300384）

除小部分病毒外，所有生命的遺傳物質(zhì)都是雙鏈DNA。DNA 分子不僅具有特異性識別能力，而且遵守嚴格的自組裝機制，因此天然的DNA 分子是研制靶向藥物載體的優(yōu)選材料。近幾年悄然發(fā)展起來的DNA折紙術（DNA origami），就是一種采用計算機精準設計進行核酸納米材料自組裝的新方法[1-2]。2008 年丹麥Aarhus 大學的Andersen[3]開發(fā)了一款UNIX 系統(tǒng)適用的DNA 折紙軟件——SARSE，利用該軟件首先進行了DNA 二維結構設計，成功得到了約50nm×150nm 尾巴酷似在擺動的海豚圖案；不久后該團隊又設計出一個帶有可“開-關”蓋子的DNA 盒子，將該軟件用于了DNA 三維折疊設計[4]。DNA 折紙用到最多的開源軟件是Douglas設計的caDNAno，研究者可利用其中的蜂巢模型或方格模型進行腳手架鏈和訂書釘鏈的設計，在二維界面構建堆疊DNA 圖形[5]。麻省理工學院（MIT）Bathe 團隊研發(fā)的CanDo 和DAEDALUS，是目前進行DNA 三維立體設計功能最完善的軟件，CanDo是一款在線分析軟件，能依據(jù)caDNAno 的設計圖進行DNA立體結構預測[6]；DAEDALUS 是由Matlab編寫的涵蓋多種立體構象的源代碼，Bathe 團隊依靠這種軟件，采用M13mp18 單鏈環(huán)形DNA 構建出了立方體、正八面體、正二十面體等納米結構DNA[7]，最近該團隊還報道了使用caDNAno 構建了結構復雜的荷花型和貝殼形DNA納米材料[8]。2006年上海交通大學Bio-X 中心，同樣采用M13mp18單鏈核酸折疊出一幅中國地圖[9]。從前期研究可以看出，人們已經(jīng)能夠?qū)⒁粋€單鏈核酸折疊成各種盡可能復雜的圖形，M13mp18 單鏈環(huán)形DNA 是進行這種單鏈折疊的主要材料。但如何將DNA 折紙術用于普通基因組核酸材料，如何將這項技術應用到實際的研究領域中，都是該項技術是否能得到廣泛應用的關鍵。

本文作者項目組即以此為目的，采用生物實驗室最常用的模式菌株E.coliK-12 MG1655，作為琥珀酸脫氫酶sdhC 基因的供體菌。sdhC 是中心代謝的一個基因，在生命體中普遍存在，其研究結果具有一定的代表性。首先利用改進后的DAEDALUS軟件，設計出與sdhC 基因序列互補的16 條訂書釘鏈[10]。這16 條訂書釘鏈與PCR 擴增得到的sdhC 雙鏈DNA 進行鏈內(nèi)置換，最終組裝出了與預設模型基本一致的正四面錐。在實驗中發(fā)現(xiàn)，sdhC 基因的核酸鏈在自組裝前后，DNA 凝膠電泳條帶的位置發(fā)生了明顯變化。采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）進行觀察，發(fā)現(xiàn)樣品為均勻分散的錐形顆粒，尺度約為15.02～23.97nm。采用原子力顯微鏡進行該納米錐液下的三維立體結構成像，可觀測到一個完整清晰的正四面錐體，說明大腸桿菌的普通基因序列，被成功組裝成了一個對稱的納米錐結構。這種核酸納米錐具有很強的生物相容性，可以幫助尺度適宜的藥物進入目標細胞，提高藥物精準釋放和靶向作用的能力。

1 實驗材料和方法

1.1 sdhC基因納米錐設計

首 先 改 進 DAEDALUS 軟 件 中 的DX_cage_design模塊，使該軟件能讀取sdhC基因的核酸序列。按照Waston-Crick 的B 型DNA 雙螺旋模型，每螺旋為10.5 個堿基對時，DNA 折疊的應力最小，所以待設計的正四面錐的每條棱應有n10.5bp（n為正整數(shù)）個堿基，且由兩條訂書釘單鏈和兩條腳手架鏈組成。在DAEDALUS源代碼中，加入一個求余函數(shù)rem（edge_length，21），檢測每條棱的堿基數(shù)是否為21bp 的整數(shù)倍，如果不是，程序則會自動在棱上增加5、10 或11 個堿基。同理，DAEDALUS 輸出訂書釘鏈也會盡量接近n21bp，以保證核酸自組裝時不產(chǎn)生過度彎曲[11]。理論上DAEDALUS 允許輸入腳手架鏈的堿基個數(shù)沒有限制，但是源代碼中的參數(shù)均依照M13mp18單鏈DNA（7249bp）設定。為重新設定計算參數(shù)，對sdhC 基因序列進行了上下游延伸處理，即在sdhC基因序列上下游各補充117bp，其基因圖譜如圖1 所示，總長為624bp，其中118～507bp 為sdhC基因。將該624bp 的堿基序列作為腳手架鏈輸入DAEDALUS軟件，腳手架鏈序列如表1所示。經(jīng)過計算正四面錐各棱含有兩組堿基數(shù)為52bp 的DNA雙鏈，圖1中的箭頭表示折疊后每條棱對應的堿基位置，AD 棱的堿基序列包括（1，33）、（606，624）、（138，189）；CD棱包括（34，86）、（503，553）；BD 棱包括（87，137）、（242，294）；AB 棱包括（190，241）、（348，399）；BC 棱包括（295，347）、（452，502）；AC棱包括（400，451）、（554，605）。

表1 腳手架鏈堿基序列

圖1 sdhC基因納米錐腳手架鏈基因圖譜

圖2 sdhC基因納米錐設計圖（1?=0.1nm）

圖2為sdhC基因納米錐的設計過程，深色粗實線代表腳手架鏈，淺色粗實線代表訂書釘鏈。624bp 的腳手架鏈在16 條互補的訂書釘鏈作用下，不中斷地來回折疊，每條棱都是由兩條腳手架單鏈和兩條互補的訂書釘單鏈相互纏繞形成[12]。如圖2(c)所示，正四面錐6條棱的設計略有不同，根據(jù)腳手架鏈的形態(tài)可分為兩組：第一組AB、AC、AD為無隔斷棱；第二組BC、BD、CD 為有隔斷棱，腳手架鏈的3’端和5’端均在AD棱上。訂書釘鏈共有4 種類型，分別為回型（Clip）、鉤型（Hook）、夾型（Pin）以及凸型（Convex）。圖2(a)給出了與頂點B相連的3條棱的結構，每條棱兩端皆是部分凸型鏈，BC 與BD 棱中部由兩個31bp 的鉤型釘書釘鏈形成，AB棱中部由一條長42bp回型訂書釘鏈和一條20bp 夾型訂書釘鏈形成。棱結構AD、AC 與AB 相同，BD、CD 與BC 相同。頂點B由78bp凸型訂書釘鏈形成，如圖2(b)所示，且各頂角的訂書釘鏈形狀、長短皆相同。其中每個構成頂角的凸型訂書釘鏈中加入了一段長5bp 的poly（T）結構，與腳手架鏈不匹配，形成一個單鏈的折角。表2為在DAEDALUS輸出的16條訂書釘鏈的序列，帶下劃線的堿基表示poly（T）結構。圖2(c)為DAEDALUS 設計出的最終納米錐的立體結構，最終形成每條棱包含52bp 的正四面體，長度為17.68nm，按照B 型DNA 雙螺旋模型計算，每兩個堿基之間距離為0.34nm，所以每條棱長是52×0.34nm＝17.68nm，每條棱的兩條腳手架鏈長度相同，均為52bp，且上下各錯開一個堿基，以形成拐點，如圖2(a)所示。

1.2 實驗材料

大腸桿菌（E.coliK-12 MG1655）甘油菌為本實驗室保藏[13]；引物、訂書釘鏈、Taq DNA 聚合酶由TaKaRa 公司合成；DNA MarkerII 購自北京鼎國生物公司。實驗所用儀器包括：凝膠電泳儀（DYCP-31CN 型，北京六一生物科技有限公司）；場發(fā)射掃描電鏡（MERLIN Compact 型，德國ZEISS 公司）；原子力顯微鏡（ICON 型，德國Bruker公司）；透射電子顯微鏡（JEM-2100型，日本JEOL 電子株式會社）；PCR 儀（T-Gradient Thermoblock型，德國Biometra公司）

1.3 PCR法制備腳手架鏈

在Genebank中查詢的E.coliK-12 MG1655sdhC基因序列（Gene ID：945316，390bp），并在上下游各補充117bp，得到624bp 的堿基序列。依據(jù)該序 列 設 計 上 下 引 物 ： Primer-1 （5′-TGTCTGACCCGCAAGC-3′） ； Primer-2 （5′-CGCCACTGGTAGCGA-3′）。 提 取E. coliK-12 MG1655染色體，作為擴增腳手架鏈的模板，進行PCR 反 應[3]。PCR 反 應 體 系 為：10×PCR Buffer（Mg2+） 5μL； 4×dNTP Mixture 4μL； Primer-1（27.6μmol/L）1μL；Primer-2（28.2μmol/L）1μL；E.coliK-12 MG1655 染色體（150nmol/L）2μL；Ex Taq 酶0.25μL 及無菌水36.75μL 混勻，構成50μL PCR 反應體系。PCR 程序為：94℃預變性4min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，從第二步循環(huán)30輪后，72℃保溫10min。實驗結束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測[14]。

表2 訂書釘鏈堿基序列

1.4 自組裝sdhC基因納米錐

在200μL薄壁管中，將腳手架鏈和訂書釘鏈按照1∶10加入到自組裝緩沖溶液TAE/Mg2+中（2mol/L Tris，0.1mol/L CH3COOH，0.05mol/L 乙二胺四乙酸，12.5mmol/L Mg(CH3COO)2），混合成50μL 自組裝體系，放入可梯度控溫的PCR 儀中，組裝程序為：94℃變性4min，以0.6℃/s 的降溫速率降溫至20℃[15]，4℃保存10min。實驗結束后取出樣品進行瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）進行檢測。

2 結果與討論

2.1 sdhC基因納米錐自組裝策略

實驗中采用雙鏈DNA 作為DNA 折紙的腳手架鏈，雙鏈DNA 是包括sdhC 基因在內(nèi)的624bp 雙鏈PCR 產(chǎn)物。因此與以往使用單鏈DNA 作為腳手架鏈的自組裝策略不同，本研究采用的是一種鏈置換組裝策略，如圖3(b)所示。當加入的訂書釘鏈濃度遠遠超過雙鏈腳手架鏈時，在DNA 變性和復性過程中，訂書釘鏈取代了雙鏈DNA 中的一條鏈，發(fā)生鏈內(nèi)置換，將另一條鏈折疊為預設的核酸模型。實驗的每一步均進行了瓊脂糖凝膠電泳驗證，圖3(a)為PCR 得到的雙鏈腳手架鏈電泳圖，大小為624bp，圖3(c)為組裝前后的電泳對比圖，泳道1為16 條訂書釘鏈，均為21～78nt 的短鏈核苷酸，泳道2為雙鏈腳手架鏈，泳道3為自組裝產(chǎn)物，很明顯組裝前后的電泳條帶存在一定差距，而且沒有檢測到訂書釘鏈，說明訂書釘鏈與腳手架鏈結合后，腳手架鏈發(fā)生了折疊，形成了與組裝前不同的空間結構[16]。

圖3 sdhC基因納米錐組裝策略及凝膠電泳檢測

2.2 sdhC基因納米錐形貌分析

為了進一步分析折疊后的DNA 空間構象，將得到的自組裝產(chǎn)物超聲震蕩15～20min，取1μL 樣品涂布在云母片中央，沉積過夜，鍍金后使用SEM 進行掃描檢測。圖4 是在工作電壓10kV，工作距離13.3mm，放大倍數(shù)10萬倍條件下的sdhC基因納米錐全貌圖。從圖中可以看出，自組裝產(chǎn)物為均勻分散、邊緣清晰且結構完整的錐形納米顆粒，而在涂布了TAE/Mg2+的空白云母片上，未觀察到任何納米顆粒；左上角的插圖2 為一個錐體的放大圖，與插圖1中預設模型基本一致。通過對多次實驗樣品的不同視野中幾百個顆粒的測定，得到的納米錐平均邊長為19.05nm，與最初設計僅相差1.37nm，這有可能是儀器檢測和手動測量產(chǎn)生的誤差。圖5為SEM的能譜報告，滴加了樣品的云母片C、O的含量分別升高了9.3%、29.58%，樣品中還檢測出含0.19%的N 和1.64%的P，說明樣品為生物大分子。為了觀測自組裝產(chǎn)物在溶液中的形貌，本研究組采用TEM，取2μL 樣品進行了檢測，結果如圖6 所示，得到的三角錐邊長在（17.68±2）nm范圍內(nèi)，與SEM測定的尺度基本相符。

圖4 SEM掃描圖像

圖5 能譜分析

2.3 AFM分析

圖6 TEM掃描圖像

為了能更清晰地分析樣品在液體中的立體構型，本研究使用AFM 進行3D 分析。將新解離的1.3cm×1.8cm 云母片固定在2cm×2.5cm 的干凈玻璃片上，用透明膠將云母片表層清潔干凈，滴加3μL樣品于云母片中央，沉積3min。將BRUKER SNL-10 鍍金掃描探針，固定在液體探針夾上，并滴加30μL TAE/Mg2+緩沖溶液，進行液下檢測。AFM 檢測結果如圖7所示，樣品表面受探針壓力影響產(chǎn)生了一定的形變，但仍能觀察到清晰的錐體結構，圖7(a)是其中一個納米錐的3D 圖像，其最高峰約為2.2nm，推測應該是納米錐預設模型中的B 頂點，與B 頂點相連的3 條棱分別是CB、AB 和DB。圖7(b)為將探針與樣品間作用力轉(zhuǎn)化為樣品高度的曲線圖，即記錄了探針掃描過樣品每個點高度的數(shù)據(jù)，可以看出探針的走向是從一個低點升至一個最高點，再回到一個低點，3個方向趨勢相同，掃描過的距離即為3條棱CB、AB、DB的長度，分別為23.838nm、 15.245nm、 18.654nm， 平 均 為19.246nm；與預設模型的邊長相差1.566nm，基本符合預期設計。產(chǎn)生誤差的原因，有可能是原子力顯微鏡的探針對樣品產(chǎn)生的壓力，導致樣品形變，使測定邊長與實際邊長產(chǎn)生偏差。

3 結論

圖7 sdhC基因納米錐原子力顯微鏡3D成像圖

本研究采用E.coliK-12 MG1655琥珀酸脫氫酶C 亞基基因sdhC 核酸序列構造出一種核酸納米錐體，是首次使用普通基因的雙鏈DNA 進行DNA 折紙術設計。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）多種檢測手段驗證，sdhC 基因的雙鏈DNA 確實被組裝成了與DAEDALUS 軟件預設模型基本一致的正四面錐，但尺度上存在微小差距，且不同表征方式檢測出的差距很接近。除了考慮是儀器檢測產(chǎn)生的測量誤差外，還有可能是組裝體系中的離子強度影響了B型DNA的螺旋方式，導致DNA 復性時與標準Watson-Crick 模型產(chǎn)生了偏差。所以在今后的研究中，還需要進一步探索組裝體系和雙鏈DNA 長度對自組裝效率的影響，以及如何解決置換出的單鏈對自組裝過程干擾的問題。總之，本研究證實了雙鏈DNA 可以作為DNA折紙術的核酸材料，甚至可以按照藥物分子的需求“定制”相應的DNA藥物載體。例如，sdhC基因納米錐可以載入邊長17nm 以內(nèi)的藥物分子，幫助藥物在細胞內(nèi)定點釋放出，尤其是在惡性腫瘤細胞的精準治療中發(fā)揮一定的作用。