利用側流核酸試紙條快速檢測非洲豬瘟病毒

王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛亮

利用側流核酸試紙條快速檢測非洲豬瘟病毒

王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛亮※

（中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

為滿足基層普通實驗室或養殖場等資源有限的實驗室對非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的檢測需求，該研究開發了一種簡單、快速、低成本的檢測技術，可以用肉眼觀察檢測結果。研究將傳統聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）與膠體金試紙條技術結合，開發一種低成本的側流核酸測定試紙條（lateral flow nucleic acid assay, LFNAA）。該體系設計了獨特的尾引物，避免了傳統核酸試紙條的半抗原標記及抗體的使用。經過PCR擴增后產生一端帶著單鏈寡核苷酸尾巴的雙鏈DNA產物，能夠與膠體金標記的寡核苷酸捕獲探針結合，從而在試紙條上形成可以用肉眼觀察的目標產物。該LFNAA試紙條能夠在豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CFSV）、豬瘟病毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、豬圓環病毒1型（Porcine circovirus 1, PCV1）、豬圓環病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus virus, PPV）中特異的鑒定出ASFV的存在，其靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳的分析結果一致，均能達到103copies/L。因此，僅需要一臺普通PCR儀，即可對ASFV進行快速靈敏的鑒定（<2 h），其低成本、操作簡便的特點非常適合資源有限的實驗室中非專業人員的操作。此外，該技術可進一步結合等溫擴增技術，能夠在食品安全和醫學診斷中實現更快更簡便的現場檢測。

動物；養殖；非洲豬瘟（ASFV）；傳統PCR技術；側流核酸測定（LFNAA）；尾引物；低成本

0 引 言

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的接觸性傳染病，是最嚴重的動物疾病之一，其感染期間的臨床癥狀與豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）所見無異，且能夠導致高發病率和高死亡率[1]。該病首次發現于肯尼亞，近年來已經傳播到歐洲、非洲、美洲等地區[2]。在中國，2018年8月爆發首例ASFV疫情，截至2019年7月，已經確診了149例疫情，捕殺了超過100萬頭豬[3]。ASFV這種毀滅性疾病能夠造成受感染動物的死亡率高達100%，嚴重影響了全球養豬業的經濟發展，使得2019年豬肉價格上漲了約20%，與2018年同期相比增加30%[4]，同時也嚴重威脅著食品安全，如“三全食品的灌湯水餃中疑似檢出非洲豬瘟病毒核酸陽性”事件的發生。然而, 目前尚無有效的疫苗或者控制方法來預防該疾病的傳播，捕殺措施是唯一的防控手段[5]。因此，快速、簡便、可靠的ASFV鑒別方法對于疫情控制的具有重大的現實意義。

世界動物衛生組織（Office International des Epizooties, OIE）推薦的ASFV診斷技術[6]如紅細胞吸附試驗（hemadsorption test, HAD）、免疫吸附試驗（immunosorbent assay, ELISA）和熒光抗體試驗（fluorescent antibody test, FAT），具有較高的靈敏度，但是這些方法費時費力，限制了其使用推廣[7]。近年來，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）檢測技術包括傳統PCR、熒光定量PCR以及等溫擴增技術由于其高靈敏度和特異性成為應用最廣泛的檢測手段，同時也是OIE指定的ASFV檢測方法之一[8]。熒光定量PCR具有超高靈敏度，但該優點反而使得檢測結果容易產生假陽性結果，且對引物和探針的要求較高，需要價格昂貴的專業設備，因此對人員的專業技能要求也相對較高[9]。等溫擴增技術雖然克服了對儀器的需求，但其試劑盒的價格昂貴，而且試劑中的氣溶膠易污染形成假陽性結果[10]。相比較而言，對于一些地區特別是發展中國家，部分基層實驗室和養殖場的設備不完善、資源有限，在靈敏度和特異性能夠滿足檢測需求的基礎上[11]，傳統PCR技術價格較低，引物設計簡單，操作方便，更適合于非專業技術人員。同時，隨著便攜式PCR儀[12]的開發，傳統PCR也能夠實現現場檢測的需求。

然而，PCR擴增產物的分析技術如凝膠電泳方法，依舊對時間和技術有一定的要求，而作為快速現場分析方法的一種，便攜、低成本、易操作的膠體金試紙條已經成為近年來發展的熱點[13]，廣泛的應用于食品安全和醫學檢測[14]。目前有很多核酸側流免疫分析法（nucleic acid lateral flow immunoassay, NALFIA）是將正反引物均標記半抗原，經過PCR擴增后產生雙半抗原標記的PCR擴增產物，能夠與膠體金（AuNPs）標記的捕獲抗體和在檢測線上固定的報告抗體進行結合，從而在試紙條上發生顯色反應[15]。然而，抗體的價格昂貴且難以保存，金標抗體偶聯的過程也較為復雜，這些限制了NALFIA在現場檢測中的實際應用[16]。

因此，該研究建立了一種側流核酸測定試紙條（lateral flow nucleic acid assay, LFNAA），使用膠體金標記的寡核苷酸的捕獲探針能夠直接檢測PCR的擴增產物，在PCR正向引物標記生物素，反向引物標記Spacer C3 和一段寡核苷酸尾巴，形成尾引物，無需昂貴且難以保存的抗體，且解決了復雜的膠體金標記抗體的需求。在這種獨特的尾引物的作用下，PCR擴增產生特殊DNA 產物能夠與膠體金標記的捕獲探針結合，在檢測線上顯示紅色，從而用肉眼觀察目標產物的存在。

該研究將傳統PCR技術與膠體金試紙條技術相結合，建立了一種通過核酸檢測的LFNAA試紙條，僅需一臺普通PCR儀，即可實現快速、簡便、靈敏的ASFV鑒別（＜2 h），符合基層普通實驗室或養殖場等資源有限的實驗室中非專業人員的需求，具有巨大應用前景。此外，該技術也將應用于等溫擴增技術，以實現更快更簡便的現場檢測的技術需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2×Taq Master Mix（購自Novoprotein公司）。試紙條的有關材料，包括背板（J-A6）GL04、硝化纖維素膜（CN140）、吸水墊（H-4）（購自Millipore公司）。HAuCl4·4H2O、檸檬酸、TE緩沖液、檸檬酸三鈉和鏈霉親和素（SA）（購自Sigma公司）。NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl 均為國產分析純（國藥控股化學試劑有限公司）。熒光定量PCR試劑盒（購自Kapa公司）。熒光定量PCR分析采用ABI 7500儀器（購自Applied Biosystems公司）。

1.2 試驗用基因片段DNA及核酸樣品

參考GenBank中非洲豬瘟病毒主要結構蛋白基因p72基因（GenBank：AY578706）[17]，由上海生工生物公司合成基因片段。將獲得的凍干粉用TE緩沖液溶解，并根據如下公式[18]計算拷貝數，最后得到1.75×1010copies/L的ASFV基因片段。

另外，為了確保試驗的可用性以及LFNAA的特異性，提取了感染ASFV、感染豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CFSV）、以及健康豬的血液DNA，用紫外分光光度法檢測提取的DNA的濃度，其濃度均介于10～20 ng/L。同時，由本實驗室保存的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、豬圓環病毒1型（Porcine circovirus 1, PCV1）、豬圓環病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus virus, PPV）的基因片段DNA，進行交叉反應檢測。

1.3 試紙條的組裝

如圖1所示，試紙條的檢測線（T線）和質控線（C線）分別用試紙條噴膜儀（Biodot XYZ3060）噴涂5 mg/mL的鏈霉親和素（streptavidin, SA）和質控探針（提前將1 mg/mL SA與100mol/L生物素化的控制探針在室溫下孵育2 h[19]）。然后，將試紙條在37 ℃下干燥2 h，用切條機（KM-3100）切成寬度為4 mm的試紙條，密封保存。

圖1 測流核酸測定試紙條的原理

1.4 引物的設計和修飾

參照PCR引物的設計原理，使用Primer 5.0軟件對ASFV p72基因進行引物設計。然后，按照試紙條的設計模式，對引物進行修飾。為了使PCR擴增在一個特殊的無堿基位點上終止，我們在反向引物的5′端標記Spacer C3，并隨后連接一個寡核苷酸片段作為尾巴，從而形成尾引物。正向引物標記生物素。同時，為了確保LFNAA的可用性，捕獲探針與寡核苷酸尾巴互補，控制探針與捕獲探針的核苷酸序列互補。引物和探針由上海生工生物公司合成（表1）。

表1 引物和探針的序列

1.5 膠體金AuNPs和金標捕獲探針的制備

參考前人對膠體金試紙條的制備[13,15]，采用檸檬酸三鈉還原法[20]制備13 nm AuNPs。將2.0 mL 194 mmol/L的檸檬酸鈉溶液快速加入到沸騰的100 mL含有0.1% HAuCl4溶液中，當溶液的顏色由紫色變為紅色時，表示AuNPs的形成。將溶液冷卻至室溫，儲存于4 ℃。

制備金標捕獲探針[21-22]。將20L 100mol/L的捕獲探針緩慢滴加到500L 13 nm的AuNPs中，在黑暗中靜置16 h，然后滴加56L 10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（PB Buffer）（NaH2PO4/Na2HPO4，pH值7.4）和92L 2 M NaCl溶液，再次孵育8 h后，離心30 min（4 ℃，16 100）除去上清液，用0.3 mol/L NaCl（pH 7值）和10 mm PB Buffer洗滌沉淀。最后，將沉淀溶解在含0.3 mol/L NaCl的10 mm PB Buffer中，4 ℃避光保存。

1.6 PCR反應和LFNAA的檢測

使用2×Taq Master Mix在普通PCR儀中進行擴增。每50L反應混合物包括Mix 25L，正向引物和反向引物（10M）各2L，DNA模板1L，ddH2O 20L。將反應溶液充分混合后，按照以下程序進行擴增：94 ℃ 90 s；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳或LFNAA進行分析。

LFNAA檢測體系：將2L PCR產物添加到90L TE緩沖液中，加入8L金標捕獲探針。然后將混合物滴加到試紙條的樣品墊上，并在5 min內檢查結果。

判定方法：1）當樣品中含有ASFV DNA時，金標捕獲探針與陽性產物和T線的鏈霉親和素形成三明治結構，在T線上顯示肉眼可見的紅色，同時，過量的金標捕獲探針與C線上固定的控制探針結合，在C線上顯示紅色。此時T線與C線均為紅色，當T線的顏色等同或深于C線時，判定為陽性結果；2）當樣品中不存在ASFV DNA或者濃度過低不足以檢出時，T線不顯色，僅C線顯示紅色，判定為陰性結果；3）當C線不顯色時，可以判定試紙條失效。

2 結果與分析

2.1 LFNAA的原理

這項工作開發了一種成本較低的通用型側流核酸測定試紙條，將傳統PCR技術與膠體金試紙條技術相結合，基于ASFV 基因組的高度保守區域設計特異性引物，采用獨特的尾引物和膠體金標記的寡核苷酸捕獲探針，能夠直接檢測PCR的擴增產物。如圖1所示，LFNAA試紙條包括固定有5 mg/mL鏈霉親和素的T線以及固定有控制探針的C線。在檢測過程中，帶有寡核苷酸尾巴的雙鏈擴增子能與金標捕獲探針進行DNA雜交互補。在陽性產物存在的情況下，擴增子另一側標記的生物素將與T線上的鏈霉親和素結合，形成“鏈霉親和素-生物素-擴增產物-寡核苷酸尾巴-金標捕獲探針”的三明治結構，在T線顯示紅色，表明陽性結果。相反，如果沒有陽性產物，T線就不會有紅色反應。而無論如何，過量的金標捕獲探針都會繼續移動，并與C線上的控制探針雜交結合，顯示紅色，作為LFNAA的有效對照。

2.2 PCR引物和LFNAA體系的驗證

以ASFV基因片段DNA為陽性模板，以ddH2O為空白對照，驗證PCR引物和LFNAA體系的有效性。如圖2a所示，在瓊脂糖凝膠電泳中，ASFV的基因片段DNA模板呈現正確的陽性條帶，且無拖帶現象，而以ddH2O為空白對照的擴增產物沒有條帶。同樣地，當用LFNAA體系檢測擴增產物時（圖2b），陽性模板在試紙條上顯示了2條紅線，而空白對照僅在C線上出現紅色條帶，與以上描述的判定方法相一致。因此，這些結果表明，該引物可以有效地擴增ASFV p72基因，而且這種新型的LFNAA可以應用于實際的檢測，具有良好的實用價值。

1. ASFV的基因片段DNA，2. ddH2O

2.3 LFNAA的檢測限

將ASFV基因片段DNA按照10倍的梯度進行稀釋，其中1.75×105～1.75×102copies/L 的稀釋液用于測定LFNAA的檢測限，ddH2O作為空白對照。以瓊脂糖凝膠電泳為對照（圖3a），DNA模板在1.75×105～1.75× 103copies/L的濃度范圍內（泳道1~3），在電泳中的條帶亮度依次降低，而1.75×102copies/L DNA（泳道4）不能檢測出電泳條帶。同樣，在圖3 b，LFNAA試紙條在DNA模板1.75×105和1.75×104copies/L時（試紙條1和2），T線出現明顯的紅色反應，DNA模板在1.75× 103copies/L時（試紙條3），T線出現微弱的紅色條帶，而模板濃度達到1.75×102copies/L時（試紙條4），T線無紅色反應，僅在C線顯示紅色。這些結果說明，LFNAA的檢測限與瓊脂糖凝膠電泳一致，均能檢測到103copies/L的ASFV DNA模板。此外，查閱湖南國測生物科技有限公司開發的熒光定量PCR試劑盒[23]、北京森康生物技術開發有限公司開發的等溫擴增試劑盒[24]等中國動物疫病預防控制中心認可的ASFV檢測試劑盒的靈敏度，發現該研究的靈敏度與查閱結果相一致。

注：1~4分別為1.75×105、1.75×104、1.75×103、1.75×102copies/μL的ASFV基因片段DNA；5為 ddH2O

2.4 實際樣品的檢測

用OIE推薦的熒光定量PCR技術驗證實際樣品，確保模板的準確性。參考文獻中的引物[25]，上游引物為5′-GGTGTTTGGTTGTCCCAGT-3′，下游引物為5′-TAAAGTACGCCCGCATACG-3′，探針序列為5′-FAM-CTGAATCGGAGCATCCTGCCAG-TAMRA-3′。從圖4a可以看出，只有ASFV的基因片段DNA（曲線1）和從3份感染ASFV的血液樣品中（曲線2～4）提取出的DNA出現擴增，而感染CSFV的豬血液DNA（曲線5），PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段（曲線6～10），和健康豬的血液DNA（曲線11），以及ddH2O為模板的空白對照（曲線12）均無擴增現象。該結果驗證了模板的正確性，可以作為LFNAA試紙條的結果的參考。

在LFNAA試紙條中，ASFV基因片段DNA和3份感染ASFV豬的血液DNA為陽性模板，PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段，感染CSFV的豬血液DNA，和健康豬的血液DNA為陰性模板，ddH2O為空白對照（試紙條12）。從圖4b可以看出，3份感染ASFV豬的血液DNA在T線和C線上均有明顯的紅色條帶（試紙條2～4）與ASFV基因片段DNA（試紙條1）的檢測結果一致，表明了LFNAA的實用性。同時，感染CSFV的豬血液DNA（試紙條5），PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段（試紙條6～10），和健康豬的血液DNA（試紙條11）僅在C線出現一條紅色條帶，說明了其陰性結果，證明了LFNAA的特異性。

該結果證明，在實際樣品的檢測中，LNFAA能夠準確的檢測出ASFV，而不會與其他病毒出現交叉反應，導致假陽性的錯誤判斷，這與OIE推薦的熒光定量PCR的結果一致。

1.ASFV的基因片段DNA；2~4.感染ASFV豬的血液DNA；5.感染CSFV豬的血液DNA；6~10.PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段DNA；11.健康豬的血液DNA；12.ddH2O

3 結 論

為了滿足資源有限的實驗室對ASFV的檢測需求，該研究開發了一種簡單、快速、低成本的檢測技術，可以用肉眼觀察檢測結果。

1）將膠體金試紙條技術與傳統PCR技術結合，能夠大大簡化傳統PCR擴增產物的分析技術。與常見的診斷試紙條相比，該測流核酸測定試紙條采用獨特的尾引物，能夠消除復雜的半抗原標記的需要，無需昂貴的抗體，即可在檢測線上發生紅色反應，用肉眼觀察目標產物的存在。

2）將LFNAA體系應用于實際樣品的檢測，結果表明，該試紙條能夠特異性的鑒定出非洲豬瘟ASFV的樣品，靈敏度能達到103copies/L，與中國動物疫病預防控制中心認可的ASFV檢測試劑盒的靈敏度相一致。

3）該技術能夠在2 h內肉眼鑒定出結果，且操作簡單，非常適合非專業人員操作，完全能夠滿足資源相對匱乏的實驗室的低成本檢測。

由于該LFNAA技術的通用性，將來可以通過更換引物設計，即可應用于其他食品安全檢測、環境污染分析和臨床診斷的檢測中；也可以引進低成本的等溫擴增技術替換本技術中的PCR技術，使方法更進一步簡單快速方便，從而實現更快速便捷的現場鑒定。

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Rapid detection of African swine fever virus based on lateral flow nucleic acid assay

Wang Zhiying, Yu Wenjie, Xie Ruibin, Qiao Lu, Chen Ailiang※

(,,100081,)

African swine fever virus (ASFV) was a devastating contagion of swine that could cause 100% mortality of infected animals. The outbreak of ASFV in China in 2019 had caused great economic losses in the pig industry. Therefore, simple and rapid diagnostic technology was highly needed for ASFV prevention. However, most of the current detection methods, such as protein-based technology and fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) technology, required complicated and expensive instruments, as well as professional technicians. Isothermal amplification technology did not require complex instruments but needed expensive reagents, which also limited its widespread usage, especially for laboratories with limited resources. In order to meet the needs of laboratories with limited resources to detect ASFV, a new low-cost lateral flow nucleic acid assay (LFNAA) was developed by combining the traditional PCR technique and the colloid gold lateral flow technique. LFNAA could observe the test results with naked eyes. A unique tailed-primer was designed to avoid the need for complicated antigen-labeling and expensive antibody, thus the PCR could produce a double-stranded DNA product with a single-strand oligonucleotide tail at one end, then the PCR product could hybridize with a colloidal gold-labeled oligonucleotide capture probe. In the presence of the positive product, the biotin on the other end of the product would bind to the streptavidin pre-immobilized on the test line of the strip and formed a sandwich structure of "streptavidin - biotin – PCR product - oligonucleotide tail - gold-labeled capture probe", so the test line of the strip would show a red color to indicate the positive result. On the other hand, if there was no positive product in the sample, the test line would show no red color. So, the detection result could be judged by observing whether the test line has a red color. Besides, the excess gold-labeled capture probe would hybridize with the control probe on the control line, showing a red color as an assay valid control. As a verification of the assay specificity, the LFNAA system was used to identify the presence of ASFV in actual samples of CSFV, PRRSV, PCV1 and PCV2, PRV, PPV. The result showed that the LFNAA could specifically detect ASFV, which was consistent with the fluorescent quantitative PCR. And the sensitivity of the LFNAA was the same with the agarose gel electrophoresis, both could reach to 103copies/L. Therefore, the LFNAA can meet the requirements of rapid and sensitive ASFV identification with only a common PCR instrument. Its rapidity (<2 h), low-cost, and simple-operation are greatly suitable for the non-professionals in the laboratories with limited resources. LFNAA avoids the usage of the expensive antibody and the complicated process of AuNP-antibody conjugation. Furthermore, due to the generality of the technique, the more simple isothermal amplification technology is expected to replace the current PCR method to make it more convenient and simple, and realizes faster and easier field testing in food safety testing and medical diagnosis.

animal; aquaculture; African swine fever virus (ASFV); traditional PCR technique; lateral flow nucleic acid assay (LFNAA); tailed-primer; low-cost

王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛亮. 利用側流核酸試紙條快速檢測非洲豬瘟病毒[J]. 農業工程學報，2020，36(4)：294－299.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035 http://www.tcsae.org

Wang Zhiying, Yu Wenjie, Xie Ruibin, Qiao Lu, Chen Ailiang. Rapid detection of African swine fever virus based on lateral flow nucleic acid assay[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 294－299. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035 http://www.tcsae.org

2019-11-04

2020-01-01

“十三五”國家重點研發計劃2017YFC1601700

王之瑩，河南駐馬店人，主要從事食品安全檢測研究。 Email：1017258976@qq.com※

陳愛亮，山東人，博士，博士生導師，主要從事食品安全檢測研究。Email：ailiang.chen@gmail.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035

S858.28

A

1002-6819(2020)-04-0294-06