ATP在Aβ1-42導(dǎo)致的突觸可塑性損害中的作用

周治平，　鄭　戈，　賴玉潔，　王年臻，　楊國(guó)帥，　王愛(ài)岳，　余　丹

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ATP在Aβ1-42導(dǎo)致的突觸可塑性損害中的作用

周治平1，鄭戈2，賴玉潔1，王年臻1，楊國(guó)帥1，王愛(ài)岳1，余丹1

目的探討ATP在調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性中的作用。方法培養(yǎng)大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞，應(yīng)用Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞48 h，或者在Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞前30 min預(yù)先給予ATP處理細(xì)胞。應(yīng)用Alexa Fluor 488-phalloidin dye染色觀察不同處理后神經(jīng)元樹(shù)突棘的變化。同時(shí)，應(yīng)用Western blot檢測(cè)Aβ1-42及ATP處理后對(duì)PDS-95蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果ATP能減少Aβ1-42所導(dǎo)致的神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失，Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞48 h后，PSD-95蛋白水平降低；而經(jīng)過(guò)ATP預(yù)處理30 min后，神經(jīng)元PSD-95蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。結(jié)論ATP能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

膠質(zhì)遞質(zhì)；β淀粉樣蛋白；突觸可塑性

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性變，也是最常見(jiàn)的一種癡呆類(lèi)型，其主要的病理特征包括老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元死亡[1]。老年斑是由β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)沉積形成；Aβ的過(guò)度產(chǎn)生是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元能夠釋放神經(jīng)遞質(zhì)以主動(dòng)響應(yīng)外界的刺激。這些遞質(zhì)包括谷氨酰胺、ATP、D-serine等小分子[3]。

谷氨酰胺、D-serine能通過(guò)多種途徑參與神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)已經(jīng)被證實(shí)[4，5]。同樣的，研究發(fā)現(xiàn)ATP通過(guò)激活嘌呤受體增加突觸后興奮性電流EPSCs的幅值，但在海馬GABA能神經(jīng)元突觸釋放中卻起抑制作用[6]。這些研究結(jié)果提示，神經(jīng)元可能通過(guò)釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)參與神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)，并且同一種神經(jīng)遞質(zhì)可能在不同神經(jīng)元種類(lèi)或突觸中發(fā)揮不同的作用[7,8]。然而，目前對(duì)ATP在阿爾茨海默病突觸功能障礙中作用機(jī)制的研究還遠(yuǎn)不及谷氨酰胺、D-serine等深入，但ATP產(chǎn)生障礙或不足所造成的損害作用是肯定的。因此，本實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)觀察，補(bǔ)充ATP后對(duì)Aβ1-42導(dǎo)致的突觸功能障礙的影響，旨在探討神經(jīng)遞質(zhì)ATP參與AD突觸功能障礙的分子機(jī)制，為AD的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)清潔SD孕鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0001]。從孕18 d的SD母鼠子宮內(nèi)取胎鼠，雌雄不限。從胎鼠腦內(nèi)提取海馬神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑(1)Aβ1-42、MgATP、多聚賴氨酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；(2)Neurabasal培養(yǎng)基、DMEM-F12 培養(yǎng)液、B27、胎牛血清均是Gibco公司產(chǎn)品。L-谷氨酰胺購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；(3)一抗：小鼠抗大鼠anti-PSD95 (santa，sc-32290)；二抗：堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)(碧云天，A0258)、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天，P0012A)、BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，C3206)等。

1.3主要溶液配制種植液的配方：EMDM培養(yǎng)液90 ml、10%胎牛血清10 ml、 谷氨酰胺100 μl 、雙抗100 μg(1 μg/ml)；培養(yǎng)液的配方：Neurobasal培養(yǎng)基98 ml、1%B27 2 ml、谷氨酰胺100 μl、雙抗100 μg(1 μg/ml)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)SD孕鼠腹腔注射麻醉后，開(kāi)腹取子宮獲取胎鼠，無(wú)菌條件下，斷頭至75%乙醇消毒，PBS清洗后開(kāi)顱分離胎鼠腦皮質(zhì)。將分離出的大腦皮質(zhì)置于無(wú)鈣鎂的D-hanks溶液中，將大腦皮質(zhì)剪碎，并加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液孵箱內(nèi)進(jìn)行消化15 min。消化完成后，將胰酶吸盡，加入含10%胎牛血清的種植液(DMED)終止消化。用巴氏吸管進(jìn)行吹打，然后用400目的網(wǎng)篩過(guò)濾，取細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，以800 rpm離心5 min，留取沉淀物。將沉淀物用種植液進(jìn)行重懸。以5×105/ml接種到準(zhǔn)備好的多聚賴氨酸包被的六孔板內(nèi)，置于37 ℃，5%CO2室溫培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)。種植24 h后，給予全量換液，此后間隔1 d進(jìn)行半量換液。培養(yǎng)至7 d～9 d時(shí)給予相應(yīng)的處理，收集細(xì)胞勻漿后進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

2.2細(xì)胞總蛋白提取(1)經(jīng)干預(yù)處理后的細(xì)胞，置于冰板上，吸盡培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS漂洗兩次，每次2 min，加入蛋白裂解液60 μl/孔裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮快速刮取每組細(xì)胞，用標(biāo)記好的EP管收集各組細(xì)胞；(2)收集的各組細(xì)胞裂解液置于冰上，每5 min震蕩一次，重復(fù)3次后放入4 ℃離心機(jī)，14000 rpm，15 min，吸取上清至新的標(biāo)記好的EP管；(3)留取一部分測(cè)蛋白濃度，剩余部分加入上樣緩沖液(loading buffer)后放入水浴鍋中煮沸5 min，-80 ℃冰箱保存。

2.3蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)細(xì)胞蛋白提取液混合5×蛋白上樣緩沖液。煮沸5 min，上樣。等量的蛋白樣品經(jīng)8%的SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，再經(jīng)5%BSA 封閉1 h后，加入適量稀釋的一抗(1∶1000)，4 ℃過(guò)夜。用洗滌液(washing buffer)洗膜3遍，換入相應(yīng)的二抗(1∶4000)，室溫孵育1 h，洗膜3遍，以BCIP/NBT顯色，并且進(jìn)行分析。

2.4海馬CA1神經(jīng)元圖像采集及樹(shù)突棘的形態(tài)定量分析采用LSM510 META激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)蔡司)掃描拍攝海馬CA1錐體細(xì)胞,掃描拍攝圖像經(jīng)過(guò)Neurolucida軟件繪制重塑神經(jīng)元的結(jié)構(gòu),并用Neuro Explorer軟件分別統(tǒng)計(jì)出二級(jí)樹(shù)突的樹(shù)突棘的密度。

3　結(jié)　果

3.1ATP能減少Aβ1-42所導(dǎo)致的神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞48 h，或者在Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞前30 min預(yù)先給予ATP處理細(xì)胞。應(yīng)用Alexa Fluor 488-phalloidin dye染色觀察不同處理后神經(jīng)元樹(shù)突棘的變化。經(jīng)Aβ1-42孵育后神經(jīng)元樹(shù)突棘顯著減少，而經(jīng)過(guò)ATP預(yù)處理后的神經(jīng)元樹(shù)突棘則無(wú)顯著變化(P=0.033,對(duì)照組 vs Aβ1-42；P=0.870，對(duì)照組 vs Aβ1-42+ATP；P=0.870,對(duì)照組 vs ATP,見(jiàn)表1)。

3.2ATP能拮抗Aβ1-42所導(dǎo)致的神經(jīng)元突觸蛋白PSD-95的表達(dá)減少Aβ1-42孵育原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞48 h后，PSD-95蛋白表達(dá)水平降低；而經(jīng)過(guò)ATP預(yù)處理30 min后的神經(jīng)元PSD-95蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P<0.001,對(duì)照組 vs Aβ1-42；P=0.509，對(duì)照組 vs Aβ1-42+ATP；P=0.835,對(duì)照組 vs ATP，見(jiàn)表2)。

表1　各組熒光強(qiáng)度值比較±s)

表2　各組蛋白印跡灰度值的比較±s)

4　討　論

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，神經(jīng)遞質(zhì)ATP能夠抑制Aβ1-42所導(dǎo)致的突觸功能障礙。首先，我們?cè)谠囵B(yǎng)的大鼠神經(jīng)元里證實(shí)ATP能夠拮抗導(dǎo)致的神經(jīng)元樹(shù)突棘缺失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ATP不僅能改善Aβ1-42導(dǎo)致的突觸形態(tài)學(xué)改變，還能逆轉(zhuǎn)Aβ1-42所導(dǎo)致的突觸蛋白PSD-95的減少。這些結(jié)果表明ATP能夠拮抗Aβ1-42對(duì)神經(jīng)突觸可塑性的影響而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ATP作為神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)神經(jīng)元的興奮作用是普遍存在的[9]。突觸間隙中存在著ATP的特異性水解酶(ATP酶)和腺苷三磷酸雙磷酸酶。釋放到突觸間隙的ATP及其代謝產(chǎn)物具有信息傳遞的作用。在外周，ATP可使神經(jīng)元產(chǎn)生快速的興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)[10]。Nakazawa等報(bào)道，在大鼠交感神經(jīng)元和神經(jīng)肌肉接頭處ATP不僅能直接激活膽堿能受體使離子通道自發(fā)性開(kāi)發(fā)活動(dòng)的次數(shù)提高10倍，還能使其受體通道開(kāi)放的次數(shù)明顯增加[11]。

為了進(jìn)一步研究單純ATP對(duì)神經(jīng)元的影響，同時(shí)避免其他神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酰胺、細(xì)胞因子的影響。我們應(yīng)用ATP直接處理原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，我們觀察到應(yīng)用ATP預(yù)處理神經(jīng)元30 min能夠有效逆轉(zhuǎn)Aβ1-42導(dǎo)致的神經(jīng)元樹(shù)突棘及突觸蛋白PSD-95的減少。PSD-95是突觸后致密物質(zhì)中的一種特殊蛋白，它能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用[12]。PSD-95在突觸上的數(shù)量變化是突觸功能活動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。研究表明，敲除PSD-95基因可引起小鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的改變和學(xué)習(xí)記憶功能障礙[14]。目前，LTP已被普遍認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶鞏固過(guò)程中神經(jīng)元生理活動(dòng)的客觀指標(biāo)，反映了突觸水平上的信息儲(chǔ)存過(guò)程[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到Aβ1-42能夠影響神經(jīng)元突觸可塑性，這表現(xiàn)在樹(shù)突棘數(shù)量及突觸蛋白PSD-95的減少。而ATP能夠抑制Aβ1-42對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性的影響，表現(xiàn)在補(bǔ)充ATP后神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)量及突觸蛋白PSD-95的表達(dá)增加。在神經(jīng)元樹(shù)突棘上,ATP及其偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過(guò)各種支架蛋白形成突觸后致密區(qū)(PSD),它含有幾百種蛋白質(zhì)。這種復(fù)雜而精巧的棘突結(jié)構(gòu),是接收突觸前信號(hào)并進(jìn)行生化加工的獨(dú)立單元。樹(shù)突棘能對(duì)接收的大量信號(hào)進(jìn)行神經(jīng)計(jì)算和整合,并依據(jù)刺激的方式做出反應(yīng),使突觸的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生相應(yīng)變化,即形成突觸的可塑性。而突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的分子機(jī)制與認(rèn)知功能相關(guān)。

5　結(jié)　論

我們的研究發(fā)現(xiàn)ATP能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性。在AD中，由于Aβ所導(dǎo)致的樹(shù)突棘及突觸蛋白PSD-95的減少能夠被ATP所抑制，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。因此，有效控制ATP的釋放或糾正ATP生成不足可能成為治療AD的潛在靶點(diǎn)。

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The effect of ATP on Aβ1-42mediated disruption of synaptic plasticity

ZHOUZhiping,ZHENGGe,LAIYujie,etal.

(DeparmentofNeurology,HaikouPeople’sHospital,Haikou570208,China)

ObjectiveThis study was conducted to investigate the effect of ATP in regulatory on synaptic plasticity.MethodsPrimary neurons were cultured successfully.Neurons were treated with Aβ1-42or ATP.The neuronal spine loss and PSD-95 expression were studied by using immunohistochemistry and Western blotting,respectively.ResultsWe found that exogenous ATP protected Aβ1-42mediated reduction in synaptic molecules,such as PSD-95 and prevented Aβ1-42induced spine reduction in cultured primary hippocampal neurons.ConclusionOur findings suggested that ATP plays a protective role against Aβ1-42mediated disruption of synaptic plasticity.

Neuron；Amyloid-β；Synaptic plasticity

1003-2754(2016)08-0724-03

2016-04-18；

2016-05-29

(1.海口市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570208；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

周治平，E-mail：zzping@yeah.net

R749.1

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