油酰乙醇胺對糖尿病大鼠腦內炎性因子及神經相關因子表達的影響

劉金鳳　許東偉　王幼娟　楊武雙

[摘要] 目的 探討油酰乙醇胺（OEA）對糖尿病小鼠腦內炎性和神經營養因子的影響。方法 采用高脂高糖加STZ鏈脲佐菌素（STZ）誘導T2DM小鼠模型，OEA[15、30、60 mg/（kg·d）]連續腹腔注射給藥6周，通過Real time-PCR及Western blot檢測海馬內白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、突觸成長相關蛋白-43（GAP-43）、突觸素（SYN）、BDNF和NT-3的mRNA和蛋白表達水平。結果 糖尿病模型小鼠海馬內炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達水平下降，并顯著上調海馬內GAP-43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表達水平。結論 OEA具有降低糖尿病后海馬內炎癥，增加海馬內突觸相關因子和神經營養因子的作用，從而發揮神經保護作用。

[關鍵詞] 油酰乙醇胺;糖尿病腦損害;海馬;神經保護

[中圖分類號] R961? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1672-4062（2020）01（a）-0015-03

Effects of Oleoylethanolamine on the Expression of Inflammatory Factors and Neuro-related Factors in the Brain of Diabetic Rats

LIU Jin-feng1， XU Dong-wei1， WANG You-juan1， YANG Wu-shuang2

1.Department of Pharmacy， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China; 2.Department of Neurosurgery， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of oleoylethanolamine（OEA） on inflammatory and neurotrophic factors in the brain of diabetic mice. Methods T2DM mouse model was induced by high-fat， high-glucose and STZ streptozotocin （STZ）， OEA[15， 30， 60 mg/（kg·d）] was administered by intraperitoneal injection for 6 weeks， through Real time-PCR and Western blot analysis of interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， synaptic growth-related protein-43 （GAP-43）， mRNA and protein expression levels of synaptophysin （SYN）， BDNF and NT-3. Results The expression levels of inflammatory cytokines IL-6， IL-1β and TNFα in hippocampus of diabetic mice decreased， and the expression levels of GAP-43， SYN， BDNF and NT3 mRNA in hippocampus were significantly up-regulated. Conclusion OEA can reduce the inflammation in the hippocampus after diabetes， increase the synaptic related factors and neurotrophic factors in the hippocampus， and thus exert neuroprotective effects.

[Key words] Oleoylethanolamine; Diabetic brain damage; Hippocampus; Neuroprotection

2型糖尿病（T2DM）是最常見的內分泌疾病之一，患者血糖控制不足，常出現繼發性并發癥，繼發視網膜病變、腎病、心肌病和腦病等多系統損害。糖尿病腦病（DE）或糖尿病相關認知功能減退（DACD），是糖尿病患者中樞神經系統中的一系列神經化學、神經生理和結構異常，其中包括糖尿病后引發的認知功能障礙、腦信號傳導異常、神經傳遞和突觸可塑性變化以及底層結構改變[1]。雖然糖尿病學習記憶障礙的多因素發病機制尚不完全清楚，但涉及到晚期糖基化終產物（AGEs）的形成和Tau蛋白過磷酸化[2]等因素，都是阿爾茨海默病（AD）的主要病理標志物，因此也有很多人將AD作為2型糖尿病腦病進行研究。

神經元丟失是學習記憶能力的結構性缺陷，在突觸紊亂、信號障礙、神經遞質障礙和認知功能障礙中起著重要作用，由高血糖引起的海馬依賴空間記憶損傷與神經元損傷的恢復，甚至是丟失都存在著重要關系，已有大量研究數據表明慢性神經元丟失是糖尿病與AD聯系的關鍵機制[3]。因此，可推測具有神經保護能力的藥物對糖尿病認知缺陷的治療是具有一定積極作用的。過氧物酶體增殖物激活受體α（PPARα）在中樞神經系統中發揮重要作用，如能量代謝、神經傳遞、維持氧化還原內穩態、自噬等。最近研究顯示PPARα受體激動劑具有抑制β淀粉樣沉積、Tau蛋白過度磷酸化和神經炎癥作用[4]。然而，PPARα通路對糖尿病腦病的作用尚未在糖尿病小鼠進行測試。

油酰乙醇胺（OEA）是一個有力的內源性PPARα激動劑，前期研究表明，長期OEA治療對大鼠腦缺血損傷具有認知功能恢復和神經保護作用，另一方面， OEA可通過G蛋白偶聯受體（GPR） 119的激活有效抑制高血糖。最近的研究表明，OEA類似物丙二酸-2-磺酸-9-烯酰酰胺（N15）在高脂飲食（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導的T2DM小鼠中發揮降糖作用[5]。在過去的研究中顯示OEA治療可以抑制缺血性中風誘導的細胞炎癥以及具有調控神經營養因子的作用，而這些作用均由PPARα信號介導[6]。因此，在該研究中，探討了OEA對HFD+STZ誘導的糖尿病小鼠海馬內炎癥因子以及神經營養因子的影響，為研究OEA對糖尿病后認知障礙的影響提供理論依據，現報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 藥品

油酰乙醇胺（OEA）（廈門大學手性重點實驗室合成提供）。

1.2? 實驗動物

（25±2）g SPF級C57BL/6J雄性小鼠，合格證號為SCXK（京）2016-0041，常規嚙齒類動物飼料喂養。

1.3? 動物實驗

50只上述雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后，隨機分為5組，每組10只，除正常組外，其余給予高脂高糖飼料喂養6周造模，空腹血糖≥11.1 mmol/L為成功，將小鼠隨機分成3組，即模型組、OEA低、中、高劑量治療組，正常組和模型組小鼠分別給予含1%吐溫80的生理鹽水0.2 mL/（kg·d）腹腔注射，其余小鼠隨機分為OEA低、中、高劑量治療組，分別給予OEA 15、30和60 mg/（kg·d）腹腔注射，連續給藥6周。

1.4? Real time-PCR法檢測

給藥6周后，按照熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行實驗，操作在冰上進行，PCR結束后得到擴增曲線和 Ct值。

1.5? Western blot法檢測

給藥6周后，BCA試劑盒蛋白定量，蛋白通過SDS-PAGE電泳，并通過濕轉轉移到PVDF膜，使用Image Station 4000 R的掃描光密度測定法將蛋白質帶可視化和定量。

1.6? 統計方法

采用 Graphpad Prism7.0 軟件進行數據處理分析，實驗結果以（x±s）表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 糖尿病腦病小鼠海馬內炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達水平

在給予不同濃度OEA注射給藥6周后，通過Real time-PCR以及western blot對小鼠海馬內IL-6、IL-1β和TNFα的mRNA以及蛋白表達量進行測定。如圖1所示，與Normal組相比，DM組小鼠海馬內IL-6和IL-1β mRNA以及TNFα的蛋白表達量均明顯增加（P<0.01），在分別給予15、30、60 mg/（kg·d）OEA治療后，小鼠海馬內IL-6和IL-1β mRNA下調，差異有統計學意義（P<0.05），海馬內TNFα蛋白表達量也明顯降低，因此可以推測OEA可降低II型糖尿病海馬內炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達。

2.2? 糖尿病腦病小鼠海馬內GAP43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表達

在給予不同濃度OEA注射給藥6周后，通過Real time-PCR測定，如圖2所示，與正常組相比，模型組小鼠雙側海馬內GAP43和SYN的mRNA明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），小鼠海馬內GAP43和SYN mRNA增加，差異有統計學意義（P<0.05），即OEA可對糖尿病后小鼠海馬突觸可塑性進行調節;同時，小鼠海馬內NT3和BDNF的mRNA明顯增加，因此可以推測OEA可明顯提高2型糖尿病后小鼠海馬內神經營養因子BDNF和NT3的表達。

3? 討論

OEA是一種內源性 PPAR-α激動劑，在脂質代謝，改善腦供血和增加神經功能方面具有多種作用，并且有這方面的報道，而對糖尿病腦部損害的研究未見報道，腦部炎性因子的表達過度可以損害腦功能，炎性因子表達在腦卒中、腦外傷等腦部損害中明顯增加，神經相關因子表達下降直接損害腦功能，所以炎性因子和神經相關因子在糖尿病腦損害中的表達如何，OEA是否可以降低炎性因子的表達，提高神經相關因子的表達，以改善糖尿病的腦損害，為預防和治療提供新的途徑。

已有大量實驗資料表明，體內IL-6的異常與多種腦部疾病相關，TNFα是一種典型的促炎細胞因子，其在啟動先天免疫系統的炎癥反應中起重要作用，部分通過誘導其他細胞因子的表達和釋放，通過該次的研究發現腦內IL-6、IL-1β和TNF-α表達糖尿病組明顯升高，經過OEA治療后明顯下降，即說明OEA可以抑制腦內炎癥因子的表達，從而發揮抗炎作用。

海馬區域的神經營養和神經可塑性對許多神經系統相關疾病的致病和治療因素敏感。神經可塑性是指大腦在一生中適應、改變和重組的能力，突觸可塑性是認知功能的重要方面。為了更好地理解OEA對改善T2DM后認知障礙的作用，該次評估了慢性OEA治療對神經可塑性以及突觸可塑性的影響。GAP-43是一種神經特異性軸突蛋白，在神經突生長調控、生長錐引導和突觸可塑性等方面發揮重要作用。SYN是突觸前泡蛋白，在突觸發生和突觸功能中具有神經保護作用，通常反映突觸數量和密度。該次的數據顯示糖尿病小鼠海馬區的GAP-43和SYN水平顯著下降。這表明這些變化可能與糖尿病后的認知缺陷和神經元丟失有關。然而，OEA處理顯著增加了GAP-43和SYN的表達，說明OEA可能通過增強突觸可塑性來改善糖尿病引起的認知障礙。該次的數據證實糖尿病小鼠海馬中BNDF和NT3水平下降，而OEA處理顯著提高了BNDF和NT3的水平。這種靶向的改善海馬神經營養和神經可塑性可能是降低DE風險和改善DE結果的潛在策略。

綜上所述，結果顯示OEA具有抑制糖尿病后海馬內炎癥因子分泌，調節神經可塑性的作用，而這些作用與糖尿病腦病的進程和發展息息相關，因此推測OEA是一種具有減輕糖尿病引起的認知功能缺陷的潛力的神經保護制劑，可用于糖尿病腦病藥物的研究。

[參考文獻]

[1]? Bhutada P，Mundhada Y，Bansod K，et al.Protection of cholinergic and antioxidant system contributes to the effect of berberine ameliorating memory dysfunction in rat model of streptozotocin-induced diabetes[J].Behavioural brain research，2011，220（1）：30-41.

[2]? Aulston BD，Schapansky J，Huang Y，et al.Secreted amyloid precursor protein alpha activates neuronal insulin receptors and prevents diabetes-induced encephalopathy[J].Experimental neurology，2018（303）：29-37.

[3]? Pugazhenthi S，Qin L，Reddy PH.Common neurodegenerative pathways in obesity， diabetes， and Alzheimer's disease[J].Biochimica et biophysica acta，2017，1863（5）：1037-1045.

[4]? D'Orio B，Fracassi A，Ceru MP，et al.PPARalpha in Alzheimers disease[J].Curr.Alzheimer Res，2018（15）：345-354.

[5]? Ren T，Yang WS，Lin Y，et al.A novel PPARalpha/gamma agonist， propane-2-sulfonic acid octadec-9-enyl-amide， ameliorates insulin resistance and gluconeogenesis in vivo and vitro[J].European journal of pharmacology，2018（826）：1-8.

[6]? Zhou H，Yang WS，Li Y，et al.Oleoylethanolamide attenuates apoptosis by inhibiting the TLR4/NF-kappaB and ERK1/2 signaling pathways in mice with acute ischemic stroke[J].Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology，2017，390（1）：77-84.

（收稿日期：2019-10-12）