肝癌患者血清microRNA-363水平在診斷和病情評估中的價值

楊健，楊超，李劍輝

（1.臺州醫院 肝膽胰外科，浙江 臺州 317000；2.臺州醫院 血液凈化中心，浙江 臺州 317000；3.浙江大學醫學院附屬第一醫院 肝膽胰外科，浙江 杭州 310003）

肝癌為常見的惡性腫瘤，全球范圍內病死率較高。肝癌的早發現、早診斷對提高療效和改善預后具有重要作用。目前臨床上應用最廣泛的診斷肝癌的血清學標志物為甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP），但單一指標的診斷敏感性和特異性有限[1]。microRNA（miRNA）為非編碼小RNA，參與機體發育、新陳代謝、細胞增殖及凋亡、腫瘤發生和發展等過程。多種miRNA在肝臟中表達，miRNA表達量異常與肝癌的發生、發展關系密切。miRNA在血液中具有較高的穩定性，因此測定血清miRNA水平對肝癌的診治具有重要價值[2]。microRNA-363（miR-363）在多種惡性腫瘤細胞中表達異常，參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程[3-4]。但肝癌患者血清miR-363水平尚不清楚，本文擬探討肝癌患者血清miR-363水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年12月臺州醫院肝膽胰外科收治的肝細胞肝癌患者86例作為肝癌組。其中，男性72例，女性14例；平均年齡（52.37±8.16）歲；平均腫瘤直徑（4.65±1.24）cm；單發腫瘤37例，多發腫瘤49例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期19例，Ⅲ期38例，Ⅳ期7例；有轉移42例，無轉移44例；腹水31例，肝硬化47例，食管胃底靜脈曲張15例，門靜脈高壓21例。選取同期本院健康體檢者86例作為對照組。其中，男性68例，女性18例；平均年齡（51.79±9.42）歲。納入標準：①肝癌組經病理確診為肝細胞肝癌、首次診治；②對照組均身體健康；③患者資料完整，簽署知情同意書。排除標準：①其他惡性腫瘤者；②自身免疫性疾病者；③急、慢性感染性疾病者；④嚴重心、肝、腎功能異常者；⑤糖尿病、高血壓等慢性疾病者。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經臺州醫院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 標本采集抽取患者空腹靜脈血4 ml，4℃、1 000 r/min離心10 min，分離血清，吸出上清液置于離心管中，4℃、5 000 r/min離心10 min，留取上清液置新的離心管中，于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miR-363水平測定從-80℃冰箱中取出血清，室溫解凍，待血清完全溶解后，取200μl至滅酶、滅菌EP管中，采用Trizol試劑提取總RNA，根據RT-PCR試劑盒（美國Sigma公司）說明書將RNA逆轉錄為cDNA，并置于-80℃冰箱中保存。利用NCBI數據庫確定miR-363引物序列（正向引物：5'-ACAC TCCAGGTGGGAATTGCACGGTGTCCA-3'，反向引物：5'-TGGTGTGGTGGAGTCG-3'，長度22 bp），以U6為內參照（正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AAGGCTTCACGAATTTGCGT-3'，長度23 bp），采用RT-PCR測定血清miR-363水平，反應條件如下：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，共38個循環。以2-ΔΔCt法計算血清miR-363相對表達量。

1.2.3 血清AFP水平測定采用電化學發光法測定血清AFP水平，試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司。

1.3 診斷標準

1.3.1 肝硬化肝組織病理學檢查同時表現為彌漫性肝纖維化和結節形成則可診斷為肝硬化[5]。

1.3.2 門靜脈高壓①巨脾；②血小板＜100×109/L 和/或白細胞＜4×109/L；③門靜脈寬度＞14 mm或脾靜脈寬度＞10 mm；④胃鏡下胃底靜脈曲張或存在腹水；⑤胃鏡下食管靜脈曲張。符合≥2項則可診斷為門靜脈高壓[6]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-363和AFP水平

兩組血清miR-363相對表達量和AFP水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），肝癌組血清miR-363低于對照組，AFP高于對照組。見表1。

表1 兩組血清miR-363相對表達量和AFP水平比較 （n =86，±s）

表1 兩組血清miR-363相對表達量和AFP水平比較 （n =86，±s）

組別 miR-363 AFP/（ng/ml）對照組 1.00±0.07 3.26±0.24肝癌組 0.38±0.05 624.34±46.31 t值 66.838 124.307 P值 0.000 0.000

2.2 不同因素患者的血清miR-363相對表達量比較

不同TNM分期、有無轉移患者的血清miR-363相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤個數、有無腹水、肝硬化、食管胃底靜脈曲張、門靜脈高壓患者的miR-363相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 肝癌患者血清miR-363與AFP的相關性

Pearson相關性分析顯示，肝癌患者血清miR-363與AFP呈負相關（r=-0.502，P=0.000）。

2.4 血清miR-363與AFP診斷肝癌的價值

血清miR-363、AFP分別以0.47和400 ng/ml作為臨界值，繪制ROC曲線。miR-363、AFP及miR-363+AFP診斷肝癌的ROC曲線下面積分別為0.742（95% CI：0.740，0.747）、0.884（95% CI：0.881，0.887）和0.938（95% CI：0.935，0.941），敏感性分別為90.7%（95% CI：0.876，0.932）、87.2%（95% CI：0.843，0.900）和82.6%（95% CI：0.796，0.855），特異性分別為66.3%（95% CI：0.643，0.673）、80.2%（95% CI：0.782，0.824）和93.0%（95% CI：0.903，0.962）。見圖1。

表2 不同因素患者的血清miR-363相對表達量比較 （±s）

表2 不同因素患者的血清miR-363相對表達量比較 （±s）

因素 n miR-363 t值 P值年齡 ＜60歲 47 0.41±0.10 1.932 0.057 ≥60歲 39 0.37±0.09性別 男 72 0.39±0.12 0.877 0.383 女 14 0.36±0.10腫瘤直徑 ＜5 cm 44 0.40±0.11 1.929 0.057 ≥5 cm 42 0.35±0.13腫瘤個數 單發 37 0.39±0.10 1.030 0.306 多發 49 0.37±0.08 TNM分期 Ⅰ、Ⅱ期 41 0.51±0.09 12.136 0.000 Ⅲ、Ⅳ期 45 0.30±0.07因素 n miR-363 t值 P值轉移 有 42 0.33±0.06 10.454 0.000 無 44 0.49±0.08腹水 有 31 0.36±0.14 1.831 0.071 無 55 0.41±0.11肝硬化 有 47 0.37±0.09 1.680 0.097 無 39 0.41±0.13食管胃底靜脈曲張 有 15 0.37±0.11 1.730 0.087 無 71 0.42±0.10門靜脈高壓 有 21 0.36±0.10 1.403 0.164 無 65 0.39±0.08

圖1 miR-363、AFP及miR-363+AFP診斷肝癌的 ROC曲線

3 討論

肝細胞肝癌起病隱匿、惡性程度高，早期診斷及手術切除是延長患者生存期的關鍵。影像學檢查是發現肝癌的重要方法，但多數影像學檢查發現的肝癌已為晚期，錯過手術機會。除了影像學方法外，血清AFP水平在肝癌的輔助診斷中也具有重要價值，但單一AFP對肝癌的診斷效率有限，有部分早期肝癌患者被漏診，因此探討肝癌的其他血清學診斷標志物具有重要價值[7]。

miRNA在人類基因調控中發揮重要作用，某個miRNA的變化可引起數百個靶基因表達水平異常，并可引起轉錄組基因表達譜的改變[8]。轉錄基因表達譜的改變在多種疾病的發生、發展中發揮重要作用，多種惡性腫瘤的發生可能與miRNA表達譜的改變有 關[9]。肝臟組織含有豐富的miRNA，肝臟中的miRNA可通過病毒顆粒分泌、外泌體分泌、凋亡及壞死等過程釋放進入外周血中，引起血液循環中miRNA水平異常。因外周血中miRNA表達相對穩定，因此血清miRNA在早期肝癌的診斷中具有一定指導價值[10]。

miR-363為miRNA的一種，具有廣泛生物學效應，在多種惡性腫瘤細胞中表達異常，參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程[11]。如miR-363可影響喉癌細胞增殖、侵襲和凋亡[12]；miR-363-3p通過靶向丙酮酸脫氫酶B調節膠質瘤細胞生長和侵襲[13]；miR-363通過調節上皮-間質轉化抑制上皮性卵巢癌的順鉑化學抗性[14]；miR-363可調節肝細胞肝癌奧沙利鉑耐藥 性[15]；miR-363可作為結直腸癌的診斷標志物[16]。miR-363在肝癌中的作用也受到大家關注，如姜哲 等[17]研究發現miR-363可通過靶向調控E2F3影響肝癌細胞HepG2的增殖和凋亡。胡建軍等[18]研究發現肝癌HepG2細胞中miR-363水平下調，過表達miR-363可抑制HepG2細胞活力并誘導其凋亡，由此推測miR-363在肝癌發生、發展中可能發揮重要作用。介于miRNA在外周血中相對穩定，外周血中miR-363水平及其意義也受到大家關注。QI等[19]研究發現，水痘患者血清miR-363水平異常，血清miR-363水平可用作診斷水痘-帶狀皰疹病毒感染的生物標志物。AFAF等[20]研究發現，慢性淋巴細胞白血病患者血清miR-363水平升高。目前miR-363在肝癌中的作用主要限于細胞水平研究，肝癌患者血清miR-363水平尚不清楚。本文研究發現肝癌患者血清miR-363水平降低，血清miR-363與肝癌TNM分期、有無轉移有關。血清miR-363與AFP相比，診斷肝癌的敏感性較高，但特異性較低。miR-363在多種惡性腫瘤中表達異常，本研究發現miR-363在肝癌診斷中的特異性低，故miR-363單獨診斷肝癌價值有限，但血清miR-363與AFP聯合可顯著提高AFP對肝癌的診斷價值，可見血清miR-363水平在評估肝癌嚴重程度中具有一定價值。考慮過表達miR-363可以抑制肝癌細胞增殖，誘導肝癌細胞凋亡，當miR-363水平下降時，其對肝癌細胞增殖的抑制作用及對肝癌細胞凋亡的誘導作用下降，從而促進肝癌細胞增殖，抑制肝癌細胞凋亡。本研究結果發現，低水平miR-363可能促進肝癌細胞增殖，抑制肝癌細胞凋亡，從而誘導肝癌的發生、 發展。

綜上所述，肝癌患者血清miR-363水平降低，檢測血清miR-363水平在評估肝癌嚴重程度和輔助肝癌診斷中具有一定價值。