雌激素對縱隔子宮電切術后宮腔纖維化的影響*

高麗，池余剛，何萍，雷麗，任春燕，孟瑩

（1.重慶市婦幼保健院 婦科，重慶 401147；2.重慶醫科大學附屬第二醫院 婦科，重慶 400010）

縱隔子宮系兩側副中腎管融合后縱隔吸收受阻所致，是最常見的先天性子宮畸形，約40%縱隔子宮患者合并有不孕、產科相關并發癥及復發性流產等不良妊娠史[1]。宮腔鏡下縱隔子宮電切除術是目前最安全、有效的手術方式。有研究證實，宮腔鏡下縱隔子宮電切除術術后可提高妊娠結局[1-2]。然而縱隔子宮電切除術術后有發生宮腔粘連的可能，宮腔粘連可導致不孕、流產等并發癥。ROY等[3]認為，縱隔子宮電切除術術后給予雌激素并不能有效預防宮腔粘連的形成[3]。本文通過研究轉換生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）及結締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）的表達，探討雌激素對縱隔子宮電切除術術后宮腔纖維化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2017年6月重慶市婦幼保健院收治的110例行縱隔子宮電切除術的縱隔子宮患者（包括完全縱隔子宮和不完全縱隔子宮），分為實驗組58例（雌激素治療：補佳樂2 mg/次，2次/d，共21 d；最后10 d加用地屈孕酮10 mg/次，2次/d）[4]和對照組52例（不使用雌激素治療）。納入標準：①術前性激素6項檢查正常；②術前半年未使用激素類藥物；③術前常規檢查及癥狀提示無感染征象；④乳腺檢查無激素用藥禁忌證；⑤無子宮內膜原發或繼發性疾病；⑥無內分泌、高血壓、腎臟疾病、糖尿病、甲狀腺功能亢進癥及導致血管病變的其他合并癥；⑦宮腔鏡術中證實術前無宮腔粘連。排除標準：①既往有宮腔鏡手術操作史；②宮腔鏡證實術前有宮腔粘連；③術后未按規定服藥及定期復查；④年齡＞40歲。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

手術采用超聲監測下宮腔鏡下縱隔子宮電切除術，均為靜脈麻醉。縱隔子宮電切除術術后1個月復查宮腔鏡，經患者同意術中取少許宮內膜組織，采用美國生育學會（American Fertility Society, AFS）評分標準[5]，對宮頸情況進行AFS評分。評分內容包括粘連范圍、粘連類型及月經情況：0分為痊愈；1～4分為預后良好；5～8分為預后欠佳；9～12分為預后不良。

1.3 免疫組織化學染色

具體操作步驟按照免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）說明書進行，一抗濃度TGF-β及CTGF均為1∶100。采用Image J軟件處理圖片，采用染色強度與陽性細胞百分率積分（積分等于2項評分相加除以2）評價TGF-β和CTGF的表達。染色強度評分：染色弱評為1分；染色強度中等評為2分；染色強（深棕色）評為3分。陽性細胞百分率評分：陽性率1%～10%計1分；陽性率11%～25%計2分；陽性率26%～50%計3分；陽性率51%～75%計4分；陽性率76%～100%計 5分[6]。

1.4 RT-PCR

組織處理完成后，用Trizol提取總RNA，按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書將總RNA（1μg）逆轉錄成互補DNA。TGF-β引物序列，正向引物：5'-CTTCATGGTGGCTTTCTTCAA-3’；反 向 引 物：5'-CACTCCCCCTCACAGTAGTAG-3'，長度為264 bp[6]。CTGF引物序列，正向引物：5'-GCTCCCTGCATCTTCGGTGGTAC-3’；反向引物：5'-GGCAGTTGGCTCTAATCATAGTTGGG-3'，長度為298 bp[7]。PCR操作參照SYBR? Premix Ex Taq TMⅡ說明書。采用2-△△CT法計算TGF-β及CTGF mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 7.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、BMI、不孕率、不完全縱隔率、完全縱隔率、合并陰道縱隔率及宮腔粘連發生率比較，經t或χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。見 表1。

2.2 縱隔子宮電切除術術后1個月子宮狀況

縱隔子宮電切除術術后1個月宮腔鏡檢查顯示子宮不完全縱隔患者術后宮腔形態恢復滿意；子宮完全縱隔患者術后形成宮底粘連。見圖1。

2.3 兩組縱隔子宮電切除術術后宮腔粘連的AFS評分比較

實驗組發生宮腔粘連3例（5.2%），AFS評分（3.3±1.3）分。其中，2例AFS評分2分（預后良好），1例評分6分（預后欠佳）。對照組發生宮腔粘連1例，AFS評分2分。對照組和實驗組TCRS術后宮腔粘連發生率分別為1.9%和5.2%，經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=0.159，P=0.690）。兩組AFS評分比較，經t檢驗，差異無統計學意義（t=1.070，P=0.285）。

表1 兩組臨床資料比較

圖1 宮腔鏡下縱隔子宮電切除術術前后對比

2.4 兩組子宮內膜組織中TGF-β及CTGF蛋白的表達

兩組TGF-β及CTGF蛋白在子宮內膜腺上皮的細胞漿和細胞核上均有表達，且在子宮內膜間質細胞上也有表達。實驗組與對照組TGF-β蛋白相對表達量分別為（2.81±0.13）和（2.85±0.14），經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.237，P=0.812）。實驗組與對照組CTGF蛋白相對表達量分別為（2.56±0.12）和（2.73±0.12），經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.933，P=0.352）。見圖2、3。

圖2 兩組TGF-β和CTGF蛋白的表達 （免疫組織化學染色×200）

圖3 兩組TGF-β和CTGF蛋白相對表達量比較 （±s）

2.5 兩組TGF-β及CTGF mRNA的表達

RT-PCR結果顯示，實驗組與對照組TGF-β mRNA相對表達量分別為（3.59±0.10）和（3.41± 0.07），經t檢驗，差異無統計學意義（t=1.446，P=0.151）。實驗組與對照組CTGF mRNA相對表達量分別為（2.79±0.05）和（2.86±0.058），經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.938，P=0.350）。見 圖4。

圖4 兩組TGF-β及CTGF mRNA相對表達量比較 （±s）

3 討論

宮腔鏡下縱隔子宮電切除術是縱隔子宮治療的金標準，是目前可以單純經宮腔鏡手術矯正子宮畸形的唯一方法[8]。宮腔鏡縱隔子宮電切除術術后宮腔粘連發生率為5.3%～12.0%[9]，是較常見的并發癥。術后宮腔粘連的預防是不可忽視的問題，XIAO等[10]將縱隔子宮電切除術術患者隨機分為4組：第1組術后使用雌激素；第2組術中安置宮內節育器；第3組術中安置4 ml宮腔水囊，術后宮腔水囊保留5 d；第4組不使用以上3種輔助治療方式。分別于術后第1和3個月再次分別行宮腔鏡檢查，評估宮腔情況，最后統計結果提示術后使用雌激素、安置宮內節育器及宮腔水囊對降低縱隔子宮電切除術術后粘連發生率并無作用[10]。

宮腔粘連是指各種因素引起的子宮內膜損傷導致宮腔部分或全部封閉而發生的一系列綜合征，以月經量減少、閉經、流產及不孕等為主要表現。各類刮宮手術是引起宮腔粘連的主要原因，占宮腔粘連危險因素的75%，其中以人工流產術和自然流產術后刮宮為主，各類宮腔鏡檢查引起宮腔粘連占各類危險因素的9%[11]。宮腔鏡下宮腔粘連分離術后粘連的總體復發率為3.1%～23.5%，而重度粘連復發率為20.0%～62.5%[11]。現研究結果表明，粘連分離術后使用雌激素可降低粘連復發率，提高妊娠率[12]。本研究中粘連發生率低于以上文獻報道的發生率。使用雌激素與否的粘連發生率比較無差異，提示雌激素并不能降低縱隔子宮電切除術術后粘連的發生率，進而檢測TGF-β及CTGF的表達情況以探討相關發生機制。

TGF-β是目前公認的且研究最深入的促纖維化因子，現發現哺乳動物TGF-β有TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1活性最強。TGF-β主要是通過與特異性受體結合后，激活Smad、絲裂原活化蛋白激酶、腫瘤壞死因子受體相關因子-4等多條信號途徑產生效應，以TGF-β1/Smad信號通路的作用最顯著[13]。目前認為，CTGF是TGF-β在調節纖維組織形成中的下游調節因子[14]，TGF-β的致纖維化功能通過CTGF實現。有學者通過測定宮腔粘連患者子宮內膜中TGF-β1和CTGF的表達，發現宮腔粘連患者子宮內膜中TGF-β1和CTGF的表達較正常子宮內膜高，預測TGF-β和CTGF通過NF-κB信號通路在宮腔粘連中扮演重要角色[7]。LI等[15]通過建立宮腔粘連動物模型發現，抑制Sp1-TGF-β1/Smad-CTGF信號途徑可達到抑制子宮內膜纖維化目的，降低宮腔粘連形成率。也有學者發現，通過應用雌激素可降低TGF-β的表達，減少粘連形成，所以宮腔粘連術后應用雌激素可減低粘連的復發率[16]。趙剛等[17]研究發現，縱隔子宮電切除術術后預后不良組中TGF-β1表達增強，推測TGF-β參與縱隔子宮電切除術術后不良結局的發生。本文對比縱隔子宮電切除術術后雌激素使用與否的宮腔粘連發生率、TGF-β及CTGF的表達，發現對照組與實驗組術后宮腔粘連的發生率比較無差異，這與XIAO等[10]研究結果一致，且TGF-β及CTGF的表達比較無差異。

綜上所述，通過實驗推測雌激素不能改變縱隔子宮電切除術術后纖維化發生，可能是因為雌激素不能改變縱隔子宮電切除術術后致纖維化因子（TGF-β/CTGF）的表達所致，這為研究縱隔子宮電切除術術后粘連的發生機制提供新的思路。但仍需要擴大樣本量和加強長期隨訪工作以進一步驗證。