MicroRNA-145-3p在先天性巨結腸中的作用及機制研究*

吳凱，陳欽明，王健俊，何繼賢，余岱岳，路羿，楊六成

（南方醫科大學珠江醫院 小兒外科，廣東 廣州 510282）

先天性巨結腸（hirschsprung disease, HD）又稱無神經節細胞癥，是兒童最常見的消化道畸形之一，發病率為0.02%～0.05%，并有逐年增加的趨勢[1]。其發生的主要原因是遠端腸管神經節細胞缺如，目前其發病機制仍未完全闡明[2]。MicroRNA（miRNA）被認為是后基因時代最大的寶庫，其通過直接降解靶基因或者調節靶基因的翻譯，參與生命過程中一系列重要的病理生理過程，包括細胞增殖、分化、遷移及凋亡等[3]。 miRNA在HD中同樣具有重要作用，如miR-483-5p、miR-215及miR-206等均被證實可通過影響細胞功能參與HD的發生、發展[4-7]。通過基因芯片及實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）發現，miR-145-3p在HD病變段腸管高表達[8]。本研究將進一步明確miR-145-3p在HD中的具體作用，探索其分子機制，為其應用于HD的診治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 組織標本選取2013年2月—2018年6月南方醫科大學珠江醫院40例HD病變段腸管（HD病變腸管組）及40例正常腸管（正常腸管組）組織標本。人神經母細胞細胞株SH-SY5Y由南方醫科大學珠江醫院麻醉科饋贈，為中國科學院上海研究所細胞庫提供。所有HD患兒行鋇灌腸及病理檢查明確診斷，而正常腸管均經病理證實無異常。所有標本各收集2份，獲取后迅速置于液氮中凍存。本研究通過醫院倫理委員會批準，患兒家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，miRNeasy微量抽提試劑盒購自德國Qiagen公司，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miR-145-3p引物及miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，CCK-8購自江蘇碧云天生物技術公司，GDNF一抗及羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司，miR-145-3p mimics及陰性對照由廣州銳博生物技術有限公司提供，轉染用Lipofectamine 2000TM購自美國Thermofisher公司。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 提取組織總RNA將組織標本研磨成粉末，按照說明書使用Trizol Reagent提取總RNA，并用RNasey Mini Kit進行純化。純化后采用紫外分光光度計鑒定RNA的純度，電泳檢測RNA的完整性，于-80℃冰箱內保存。

1.2.2 qRT-PCR采用SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA檢測，嚴格按照說明書進行操作：①取2μg含有目的miRNA的總RNA，使用miRcutemiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit在miRNA 3'末端加多聚Poly A尾，再使用Oligo（dT）-Universal Tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，最終合成miRNA對應的cDNA第一鏈，反應條件：37℃預變性60 min，95℃變性5 min，60℃退火34 s，35℃延伸4 min。 ②取2μl miRNA第一鏈cDNA液，采用miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）進行miRNA熒光定量檢測，PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性20 s，60℃退火34 s，35℃延伸4 min，共45個循環。以U6為內參，檢測miR-145-3p的相對表達量。

1.2.3 細胞培養及轉染SH-SY5Y用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養，每2～3天更換1次培養基，待細胞融合度達80%～90%時進行傳代培養。細胞轉染前1天，使用6孔板接種SH-SY5Y細胞，待細胞密度達70%～80%，使用Lipofectamine 2000TM進行細胞轉染，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。實驗分miR-145-3p組和陰性對照組，陰性對照組選用miRNA模擬物（無義miRNA），miR-145-3p組選用miR-145-3p mimics。轉染后6 h去除培養基，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2正常培養用于后續實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖取轉染后的SHSY5Y細胞，0.25%胰酶消化細胞后進行離心，將細胞按5×103個/孔接種于96孔板，作用不同時間（0、24、48、72及96 h）后每孔加入CCK-8 10μl，2 h后使用酶標儀記錄450 nm各孔光密度（OD）值，繪制生長曲線。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移取轉染后細胞，胰酶消化后進行離心，無血清培養基進行細胞懸浮、計數，將細胞按1×104個/孔種植于專用于細胞遷移實驗的24孔板上，上層小室使用2% FBS完全培養基100μl， 下層小室加入600μl含10% FBS的培養基，37℃、5% CO2孵育72 h，取出小室，吸棄上室培養液，用棉簽擦去上層細胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結晶紫染色30 min，清水沖洗后進行細胞計數。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗為尋找miR-145-3p的靶點，采用miRBase及Targetscan預測發現GDNF基因的3’-UTR存在miR-145-3p的潛在結合位點。構建野生型（與miR-145-3p完全互補）及突變型（與miR-145-3p不完全互補）GDNF質粒（見圖1），與miR-145-3p模擬物共轉染細胞。取對數生長期細胞，接種至96孔培養板，在細胞生長密度至80%時進行轉染，48 h吸去培養液，加入裂解液裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，將5μl裂解產物加入100μl反應底物中，檢測熒光酶活性。取出后再加入l00μl Stop&Glo? Reagent，迅速放入檢測儀內讀取數值，根據Firefly/Renilla比值計算相對表達量。

圖1 構建的突變型及野生型GDNF質粒示意圖

1.2.7 Western blotting細胞轉染后加入蛋白質抽提試劑，細胞裂解后冰上吹打15 min，收集細胞液加入EP管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清分裝后于-80℃冰箱內保存。采用BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液，加入上樣孔后進行電泳，110 V恒定電壓下電泳至溴酚藍剛出膠底部。48 V電轉50 min將蛋白轉移至PVDF膜上，TBS漂洗后加入封閉液振蕩4 h，封閉后加入稀釋好的一抗，4℃過夜，TBS漂洗后加入HRP標記的二抗，加入電化學發光液、顯影及定影，并用Image J軟件將圖片上每個特異條帶的灰度數字化。

1.2.8 免疫組織化學染色取等量組織標本在60℃下烤片2 h，常規脫蠟水化，蒸餾水沖洗，采用微波修復法行抗原修復。過氧化氫及山羊抗血清封閉，加入1∶1 000 GDNF一抗4℃孵育過夜，陰性對照采用0.1 mmol/L PBS替代一抗，PBS沖洗后加入二抗，37℃孵育1 h。PBS沖洗3次，DAB顯色10 min，加入蘇木精復染，二甲苯透明，封片后于顯微鏡下觀察 攝片。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0及GraphPad Prism5.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗、重復測量設計的方差分析或秩和檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.O5為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HD病變腸管組與正常腸管組miR-145-3p mRNA的表達

HD病變腸管組和正常腸管組miR-145-3p mRNA相對表達量分別為（6.506±3.179）和（0.925±0.665），經t檢驗，差異有統計學意義（t=10.680，P=0.000）；HD病變腸管組高于正常腸管組。見圖2。

圖2 HD病變腸管組與正常腸管組miR-145-3p mRNA相對表達量比較 （±s）

2.2 轉染miR-145-3p模擬物對細胞增殖及遷移能力的影響

miR-145-3p組與陰性對照組miR-145-3p相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；miR-145-3p組高于陰性對照組。見表2和圖3。

表2 兩組miR-145-3p相對表達量比較 （±s）

表2 兩組miR-145-3p相對表達量比較 （±s）

組別 miR-145-3p miR-145-3p組 101.200±11.610陰性對照組 1.000±0.016 t值 -2.611 P值 0.008

圖3 miR-145-3p組與陰性對照組miR-145-3p 相對表達量比較 （±s）

miR-145-3p組與陰性對照組轉染后0、24、48、72及96 h OD值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點OD值比較，差異有統計學意義（F=53.290，P=0.000）；②兩組OD值比較，差異有統計學意義（F=23.710，P=0.000），miR-145-3p組較陰性對照組低，細胞增殖能力下降；③兩組OD值變化趨勢比較，差異有統計學意義（F=4.078，P=0.014）。兩組遷移細胞數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-145-3p組遷移到下室的細胞數減少，細胞遷移能力降低。見表3、4和圖4～6。

2.3 miR-145-3p與靶基因GDNF的作用關系

野生型GDNF與突變型GDNF轉染細胞miR-145-3p相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），野生型GDNF質粒可降低細胞miR-145-3p的表達。見表5和圖7。

2.4 miR-145-3p下調細胞GDNF的表達

miR-145-3p組和陰性對照組蛋白相對表達量分別為（0.292±0.037）和（0.466±0.035），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.876，P=0.016）。上調miR-145-3p表達后，細胞GDNF蛋白表達降低。見圖8。

表3 兩組不同時間點OD值比較 （±s）

表3 兩組不同時間點OD值比較 （±s）

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h miR-145-3p組 0.283±0.023 0.325±0.035 0.382±0.048 0.432±0.038 0.482±0.042陰性對照組 0.281±0.018 0.346±0.028 0.442±0.038 0.532±0.042 0.632±0.049

表4 兩組遷移細胞數比較 （個，±s）

表4 兩組遷移細胞數比較 （個，±s）

組別 遷移細胞數miR-145-3p組 16.00±2.280陰性對照組 48.20±6.344 t值 4.722 P值 0.009

圖4 轉染后對SH-SY5Y細胞遷移的影響 （結晶紫染色×40）

圖5 兩組OD值變化趨勢 （±s）

2.5 GDNF在HD病變段腸管中低表達

免疫組織化學法結果顯示，HD病變段腸管中僅有5例GDNF呈弱陽性表達（12.5%），另外35例患者為陰性（87.5%）；而40例正常腸管GDNF表達均呈強陽性（100.0%）。兩組GDNF蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=80.000，P=0.000）。見圖9。

圖6 兩組遷移細胞數比較 （±s）

表5 兩組野生型及突變型GDNF質粒轉染后細胞miR-145-3p mRNA相對表達量比較 （±s）

表5 兩組野生型及突變型GDNF質粒轉染后細胞miR-145-3p mRNA相對表達量比較 （±s）

組別 野生型GDNF質粒突變型GDNF 質粒 t值 P值miR-145-3p組 1.000±0.023 0.402±0.073 11.600 0.000陰性對照組 1.023±0.084 1.008±0.029 0.797 10.826

圖7 兩組野生型及突變型GDNF質粒轉染后細胞 miR-145-3p mRNA相對表達量比較 （±s）

圖9 HD病變腸管及正常腸管中GDNF的表達 （免疫組織化學染色×100）

3 討論

由于某些因素作用，使腸神經母細胞增殖、遷移及分化能力受到影響，最終細胞不能達到終點，使得遠端腸管的神經節細胞缺如，導致HD形成[9]。miRNA是非編碼RNA中的一種，長度為21～23nt，其在生命的多個環節中起重要作用[10-11]。多個miRNA被證實與HD的發生、發展關系密切，如miR-483-5p[4]、Let-7a[12]、miR-215[5-6]、miR-206[7]、miR-1324[13]及miR-192[6]等。前期研究采用miRNA微陣列基因芯片及qRT-PCR檢測發現，miR-145-3p在HD病變段腸管中存在高頻高表達[8]，但其作用及具體機制并不清楚。

miR-145-3p是一種功能強大的miRNA，其作為一個調控基因，參與細胞增殖、分化、遷移及凋亡等多個生物過程的調控。MISONO等[14]報道，miR-145-3p在肺腺癌中低表達，過表達miR-145-3p可以抑制肺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，其在肺腺癌中起著抑癌基因的作用。YAMADA等[15]報道，miR-145-3p在頭頸部鱗狀細胞癌中低表達，過表達miR-145-3p后細胞的增殖、遷移及侵襲能力均受到抑制。MATSUSHITA等[16]證實，miR-145-3p在膀胱癌中低表達，miR-145-3p可以抑制細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡，發揮抑癌基因作用。本研究結果同樣證實，上調miR-145-3p可以抑制神經母細胞的增殖及遷移，影響腸神經系統發育，在HD形成過程中發揮作用。

miRNA的作用機制有很多種，與靶基因的3＇-UTR結合進而調控細胞表達是其主要的作用方式。在不同的細胞中，miR-145-3p可與不同的靶基因結合而發揮截然不同的作用，其在HD中的作用機制不明。GDNF是神經腔質細胞衍化親神經營養因子，是重要的腸神經元及神經節細胞的營養生存因子，其與Ret基因及GDNF-α形成多聚體受體復合物[2]。GDNF不僅起到傳遞Ret基因發揮作用的信號作用，并且有協助Ret基因促進神經節細胞移行、分化及定位功能[9]。如果GDNF蛋白表達異常，就會影響神經母細胞發育，產生HD。在體內剔除鼠GDNF基因，可以導致小鼠全結腸缺乏神經節細胞，形成HD[17]。筆者通過利用miRBase、TargetScan檢索miR-145-3p的堿基序列并預測其靶基因，結果提示GDNF是其可能的靶基因。隨后采用雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-145-3p的確可以與GDNF的3＇-UTR結合影響GDNF的表達。Western blotting檢測證實，過表達miR-145-3p可以下調細胞GDNF蛋白表達，初步確認GDNF是miR-145-3p的重要分子靶標。而在組織標本中，筆者發現GDNF在HD中低表達，與miR-145-3p高表達呈負相關，進一步證實在HD形成過程中miR-145-3p發揮的作用與調控GDNF的表達有關。

綜上所述，miR-145-3p與HD發病關系密切，其可以通過調控GDNF的表達影響神經母細胞的增殖及遷移，參與HD形成。本研究為HD的診療提供一個新的重要靶點，miR-145-3p對腸神經干細胞及動物模型的影響仍有待進一步實驗證實。