丙酮酸乙酯對膿毒癥急性肺損傷大鼠的作用及其機制研究

謝娜，呂興華，于澄，高翠敏，馬玉清

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，麻醉科 甘肅 蘭州 730000）

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科常見的危重癥之一，嚴重膿毒癥患者常并發(fā)多器官損傷。肺臟往往是膿毒癥時最易受損的靶器官，在病程早期便可出現(xiàn)急性肺損傷（acute lung injury, ALI），引起呼吸系統(tǒng)功能障礙，這是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的首要病因[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1（high modility group box 1, HMGB1）是一種高度保守的核蛋白，其作為晚期炎癥因子在膿毒癥中發(fā)揮重要作用[3]。丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate, EP）是一種有效的HMGB1抑制劑，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[4]。有研究表明，EP能降低致死性膿毒癥大鼠的病死率且有效改善急性胰腺炎、病毒性心肌炎等疾病的臨床癥狀，具有一定的器官保護作 用[5-6]。但EP對膿毒癥ALI是否有保護作用及其可能機制尚未明確。本實驗采用盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，探討EP對膿毒癥ALI的保護作用，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

清潔級健康成年雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體重200～240 g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。EP（美國Sigma公司，批號：E47808），高效RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：R0010），HMGB1、Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 模型的復(fù)制

將40只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、假手術(shù)組、ALI組和EP組，每組10只。ALI組和EP組采用盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制膿毒癥模型[7]：大鼠稱重后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后固定，沿腹正中線做1.5 cm長切口暴露盲腸，在回盲瓣與盲腸末端的正中間結(jié)扎，用18 G針頭在盲腸結(jié)扎端對穿2次，形成盲腸漏，再將盲腸還納回腹腔，逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組僅翻動盲腸，不做結(jié)扎穿孔。EP組在術(shù)后6、12及18 h腹腔注射40 mg/kg EP，對照組、假手術(shù)組和ALI組在以上相同時間點腹腔注射等量乳酸林格液。EP溶液的配制方法：EP溶解到乳酸林格液中，配置成3.26 g/L的溶液，4℃冰箱保存 備用。

1.3 標本采集與觀察指標

1.3.1 標本收集模型復(fù)制24 h后心臟采血處死大鼠，沿胸骨正中線剪開胸骨，暴露肺臟，取出肺臟用無菌冷PBS漂洗表面的血液，收集肺組織標本。

1.3.2 HMGB1、TLR4及NF-κB水平剪取適量左肺組織稱重后，按1 g組織加入9 ml PBS的比例配置，再按照每20 mg肺組織加入150～200μl RIPA裂解液的比例配置，在冰上用勻漿器制備成10%肺組織勻漿，4℃、4 000 r/min離心20 min，吸取上清液， -80℃保存。ELISA試劑盒檢測肺組織勻漿中HMGB1、TLR4及NF-κB水平。

1.3.3 肺組織濕干重比取右上肺葉，用濾紙吸干肺組織表面的血液，用天平稱出的重量為濕重；將肺組織放入80℃烤箱干烤48 h后取出，稱出的重量為干重，計算肺組織濕干重比。

1.3.4 肺組織病理結(jié)構(gòu)觀察取右中肺葉，置于10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色，光鏡下觀察肺組織病理結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平 比較

各組大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水 平 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ALI組、EP組較假手術(shù)組高（P＜0.05），EP組較ALI組低（P＜0.05）；對照組與假手術(shù)組HMGB1、TLR4及NF-κB水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織濕干重比

對照組、假手術(shù)組、ALI組及EP組大鼠肺組織 濕干重比分別為（4.67±0.15）、（4.79±0.13）、（5.40±0.16）和（5.08±0.08），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.269，P=0.000）。ALI組、EP組較假手術(shù)組高（P＜0.05），EP組較ALI組低（P＜0.05）；對照組與假手術(shù)組肺組織濕干重比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平比較 （n =10，ng/ml，±s）

表1 各組大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平比較 （n =10，ng/ml，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與ALI組比較，P ＜0.05。

組別 HMGB1 TLR4 NF-κB對照組 66.96±3.75 13.87±1.44 0.89±0.07假手術(shù)組 70.30±4.29 14.96±1.39 0.92±0.08 ALI組 118.33±5.58① 50.20±2.64① 1.49±0.13①EP組 96.41±4.14①② 25.56±2.72①② 1.30±0.05①②F值 313.048 680.933 140.251 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)變化

對照組和假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫、炎癥；ALI組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)滲出、出血和大量炎癥細胞浸潤；EP組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，與ALI組相比，肺間質(zhì)滲出、出血及炎癥細胞浸潤癥狀減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理切片 （HE染色）

3 討論

本研究參照RITTIRSCH等[7]研究方法采用盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型。結(jié)果表明，ALI組大鼠24 h處死后，打開腹腔有臭味和血性腹水，腹腔內(nèi)臟器粘連嚴重，腸道充氣擴張，盲腸結(jié)扎段發(fā)黑，甚至壞死；肺組織病理學(xué)顯示肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺間隔增寬，肺間質(zhì)滲出、出血和大量炎癥細胞浸潤，提示大鼠膿毒癥ALI模型復(fù)制成功。

HMGB1被證實是導(dǎo)致膿毒癥死亡的關(guān)鍵細胞因子，其在體內(nèi)的合成釋放明顯延遲且持續(xù)時間長，對膿毒癥發(fā)展與預(yù)后均有重要影響[8]。TLR4是HMGB1重要的胞膜受體，在膿毒癥的炎癥反應(yīng)激活、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用[9]。膿毒癥時，早期炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素刺激單核/巨噬細胞，以及壞死、損傷細胞會主動或被動分泌HMGB1，釋放到細胞外的HMGB1與其內(nèi)源性配體TLR4結(jié)合，激活MyD88依賴性途徑使NF-κB活化，誘導(dǎo)下游炎癥介質(zhì)大量釋放，使內(nèi)皮細胞受損，直接或間接損傷肺的結(jié)構(gòu)和功能[10-13]。本研究ALI組大鼠HMGB1、TLR4及NF-κB水平升高，同時肺組織病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺間質(zhì)滲出、出血，大量炎癥細胞浸潤；肺組織肺組織濕干重比增加，肺水腫加重。以上結(jié)果表明，肺組織中HMGB1、TLR4及NF-κB水平與肺組織結(jié)構(gòu)的損傷、肺功能障礙相關(guān)并呈依賴性，提示膿毒癥所致ALI與HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路激活密切相關(guān)。

EP是一種穩(wěn)定性高、親脂性強的丙酮酸脂化物，作為丙酮酸的替代物廣泛應(yīng)用于動物實驗。不同的動物實驗?zāi)Ｐ妥C實，EP可以通過抑制HMGB1/TLR4信號通路的激活，抑制促炎因子的釋放，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)、肝損傷和心肌缺血再灌注損傷，保護臟器功能[14-16]。但EP作為一種有效的HMGB1抑制劑，是否通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路來發(fā)揮對膿毒癥ALI的保護作用，目前尚未完全明確。本研究觀察到，給予EP進行干預(yù)后，大鼠肺組織勻漿中HMGB1、TLR4及NF-κB水平較ALI組降低，說明HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被抑制，同時肺組織結(jié)構(gòu)和功能障礙改善，表明EP可以緩解膿毒癥ALI，推測其作用機制可能是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，減少炎癥因子釋放，減輕肺組織炎癥反應(yīng)，從而對膿毒癥ALI產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，膿毒癥所致ALI與HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路密不可分，EP干預(yù)后，可減輕肺組織結(jié)構(gòu)和功能損傷，其作用機制可能是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，減少炎癥因子釋放，減輕肺組織炎癥反應(yīng)，從而對膿毒癥ALI起保護作用，可為臨床治療膿毒癥ALI提供理論依據(jù)。